2020年10月21日，武汉大学章晓联、殷雷老师作为共同通讯作者在 Science Advances 在线发表最新研究成果 “Mycobacterial EST12 activates a RACK1–NLRP3–gasdermin D pyroptosis–IL-1β immune pathway”，该研究鉴定了一种从 M. tb H37Rv 分泌的细胞焦亡诱导蛋白 EST12（Rv1579c）。
晶诺生物为本研究构建了EST12敲除菌株并提供相关技术支持！感谢武汉大学章晓联、殷雷老师研究团队对晶诺生物的信任和大力支持！
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细胞焦亡是一种程序性细胞死亡的炎性形式，与消除病原体感染有关。该文章介绍了一种诱导巨噬细胞焦亡的结核蛋白EST12。EST12结合巨噬细胞中活化的C激酶1（RACK1）的受体，EST12-RACK1复合体募集去泛素化酶UCHL5来促进NLRP3的K48连接去泛素化，随后导致NLRP3–caspase-1/11–GSDMD–IL-1β免疫过程。EST12晶体结构分析表明，氨基酸Y80是RACK1的关键结合位点。EST12敲除菌株在体内或体外MTB感染中都显示出了高易感性。该研究首次证明了RACK1作为病原体的内源宿主感应蛋白，并且EST12-RACK1诱导的细胞焦亡在M.tb诱导的免疫中起关键作用。
表达纯化40种RD区编码蛋白，通过LDH释放实验，发现EST12（Rv1579c）具有明显的巨噬细胞毒性作用。EST12蛋白导致小鼠腹腔巨噬细胞（图1A和B）、人单核细胞THP-1（图1C）和小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）死亡（图1D）。结果表明，EST12对巨噬细胞具有较强的毒性。
图1 巨噬细胞焦亡诱导蛋白EST12的鉴定
A-D：分别用EST12和Rv1577处理小鼠腹腔巨噬细胞（A、B）、PMA分化的THP1细胞（C）、小鼠骨髓巨噬细胞BMDMS（D），采用LDH释放法分析。E：WB检测2μＭ EST12或RV1577处理巨噬细胞GSDMD活化；F：ELISA检测IL-1β分泌；G：WB检测H37Rv和H37RvΔEST12感染BMDMs细胞后caspase-1/GSDMD活性；H：LDH释放实验检测细胞毒性；I：ELISA检测IL-1β分泌；J：WB检测BCG和BCG-EST12感染BMDMs细胞后caspase-1/GSDMD活性；K：LDH释放实验检测细胞毒性，ELISA检测IL-1β分泌。
为确定GSDMD和GSDME是否参与EST12诱导的细胞死亡，2μＭ EST12刺激小鼠腹腔巨噬细胞不同时间，检测GSDMD和GSDME活性。发现2μＭ EST12刺激小鼠腹腔巨噬细胞0.5小时GSDMD全长、GSDMD N端和C端被检测到，caspase-1 P20片段裂解活性增强（图1E），巨噬细胞IL-1β分泌增加（1F），EST12进一步处理人THP-1单核细胞来源巨噬细胞，发现caspase-1和GSDMD被EST12裂解。
检测H37Rv和H37RvΔEST12感染巨噬细胞caspase-1和GSDMD活性，H37Rv∆EST12组与H37Rv组在感染后1小时内无明显变化。在刺激6h后，H37Rv在BMDMs中诱导了更多裂解的caspase-1 p20和GSDMD-N末端片段（图1G）。与之类似，H37Rv∆EST12组LDH释放和IL-1β分泌低于H37Rv组（图1H、I）。结果表明，H37Rv∆EST12组造成的炎性焦亡少于H37Rv组。在BMDMs中，与BCG相比BCG-EST12持续诱导更多的caspase-1 p20和GSDMD-N末端片段（图1J），细胞毒性和IL-1分泌量更高（图1K）。结果表明，重组BCG-EST12较BCG诱导IL-1β表达量和细胞毒性显著升高。
结果小结：EST12通过GSDMD介导巨噬细胞焦亡和炎性细胞因子IL-1分泌。
为检测细胞中与EST12相互作用蛋白，使用pull down实验和质谱检测，结果发现RACK1蛋白可能是与EST12的结合蛋白，免疫印迹进一步验证了这个结果（图2A）。将EST12-绿色荧光和RACK1-红色荧光蛋白表达质粒转染到巨噬细胞RAW264.7中，共聚焦荧光显微镜显示EST12和RACK1在细胞质中定位，产生黄色（图2B）。qPCR和WB分析结果显示，EST12刺激巨噬细胞RACK1的表达，在6h时达到峰值，然后下降（图2C）,推测EST12在早期促进RACK1的表达。
图2 EST12与RACK1相互作用诱导巨噬细胞炎性焦亡
A：RAW264.7细胞进行EST12-His pull-down实验，WB分析；B：共聚焦显微镜分析分别转染pEGFP-C1-EST12和pAsRED2-C1-RACK1的RAW264.7细胞；C：WB和qPCR分析2μＭ EST12刺激的RAW264.7细胞；D、E：LDH、ELISA分析2μＭ EST12处理WT和RACK1−/−腹腔巨噬细胞上清；F：WB检测细胞裂解液中GSDMD和caspase-1；G：2μＭ EST12处理和PI染色WT、RACK1−/−巨噬细胞；E-J：LDH、ELISA分析H37Rv和H37RvΔEST12、BCG和BCG-EST12、M. smeg和M. smeg-EST12感染WT、RACK1−/−BMDMs。
研究EST12与RACK1在巨噬细胞中相互作用，2μM EST12分别刺激WT和RACK1−/−腹腔巨噬细胞，与WT巨噬细胞相比，RACK1−/−腹腔巨噬细胞中EST12诱导的细胞毒性（图2D）和IL-1分泌（图2E）显著降低，GSDMD N片段和caspase-1 p10裂解被强烈抑制（图2F）。实时共焦显微镜分析显示，EST12导致腹腔巨噬细胞呈现典型的细胞焦亡形态：质膜破裂，多个泡状突起，细胞核内呈“煎蛋”状（图2G）。H37RvΔEST12感染WT BMDMs和H37Rv感染RACK1−/−BMDMs的细胞凋亡和IL-1β分泌无区别（图2H）。BCG-EST12和BCG感染RACK1−/−BMDMs的细胞毒性和IL-1β分泌无明显区别（图2I）。M. smeg和M. smeg-EST12实验组也是同样结果（图2J）。
结果小结：EST12通过RACK1引起巨噬细胞炎性焦亡。
对EST12-RACK1结构预测（图3B），EST12与RACK1的相互作用可能依赖于EST12的第三个螺旋状结构（E55、F76、Y80）。重组蛋白（图3C）对RAW264.7细胞裂解物进行pull down实验，然后免疫印迹分析，与EST12和EST12-D2蛋白相比，EST12-D1（C端缺失）与RACK1几乎没有相互作用（图3D），Y80A和F76A与RACK1的结合作用明显低于EST12（图3E）。与EST12相比，EST12-D1的细胞毒性作用也明显减弱（图3F、G），EST12-E55A、F76A、Y80A诱导的细胞毒性作用下降，其中EST12-Y80A最为明显（图3H、I）。同样，M. smeg-EST1-D1和M. smeg-EST12-Y80A感染引起的细胞焦亡较M. smeg-EST12减少（图3J、K）。
结果小结：EST12 C端的Y80是RACK1引起焦亡的关键结合位点。
图3 Y80是RACK1的关键结合位点
A：EST12晶体结构；B：EST12-RACK1预测结构；C：重组蛋白全长、EST12 C端缺失（EST12- D1）、N端缺失（EST12- D2）、EST12的3个突变体图示；D-E：重组蛋白pull down及WB分析；F-I：LDH分析重组蛋白不同时间、不同剂量处理腹腔巨噬细胞；J-K：LDH分析M. smeg和M. smeg-est12、EST12-D1、EST12-D2、EST12-E55A、EST12-F76A、EST12-Y80A感染BMDMs。
炎症小体的激活是对抗细菌感染的关键防御机制，细菌感染可诱发先天性免疫反应，如caspase-1激活和炎症细胞死亡。mRNA芯片分析EST12处理RAW264.7细胞，结果显示NLRP3、IL-1β、IL-6和TNF-α表达上调。8个PYRIN结构域蛋白（NLRP1b、NLRP2、NLRP3、NLRP5、NLRP6、NLRP9、NLRP12、PYRIN）通过EST12处理后，NLRP3的mRNA表达在巨噬细胞显著改变（图4A）。在EST12刺激6小时后，免疫印迹分析NLRP3蛋白表达上升达到最高（图4B）。共聚焦显微镜分析显示，NLRP3表达在EST12刺激后6小时最高（图4C）。EST12处理后，RACK1−/−中NLRP3表达明显受损（图4D）。
结果小结：EST12导致NLRP3的表达依赖于RACK1。
图4 EST12通过RACK1诱导NLRP3炎症小体的激活
A：qPCR分析EST12蛋白处理的小鼠腹腔巨噬细胞8个PYRIN结构域蛋白的mRNA表达水平；B-C：WB和共聚焦显微镜检测EST12蛋白刺激的RAW264.7细胞；D：qPCR分析EST12处理WT和RACK1−/−腹腔巨噬细胞的NLRP3 mRNA表达水平；E：IP和WB分析质粒转染后EST12刺激的RAW264.7细胞；F：WB分析裂解的BMDMs细胞的pull down蛋白；G-J：IP和WB分析EST12处理的BMDMs细胞；K：共聚焦显微镜分析EST12处理后的WT和RACK1−/−腹腔巨噬细胞；L：IP和IB分析EST12处理或未预处理的腹腔巨噬细胞。
将编码WT泛素（H-Ub）、突变H-Ub（K48）和H-Ub（K63）质粒转染至RAW264.7细胞，通过IP和WB实验，推测EST12介导了K48连接的NLRP3去泛素化（图4E）。WB分析EST12处理的RAW 264.7细胞裂解液pull down蛋白，进一步验证EST12和去泛素酶UCHL5的相互作用（图4F）。通过免疫共沉淀分析，发现在EST12处理后，NLRP3和RACK1均直接与UCHL5相互作用（图4,G-I），而EST12-Y80A处理不能促进RACK1与UCHL5、NLRP3的相互作用（图4,H和I）。UCHL5敲低株在EST12刺激后，NLRP3的K48去泛素化明显降低（图4J），结果表明EST12刺激后通过UCHL5介导NLRP3 K48连接的去泛素化。免疫荧光分析发现EST12存在时ASC斑点的形成，但在EST12处理的RACK1−/−腹腔巨噬细胞中却没有发现（图4K）。IP和WB实验发现NLRP3可以同时沉淀ASC和pro-caspase-1，ASC也可以沉淀NLRP3和pro-caspase-1（图4L）。
结果小结：在EST12处理后，NLRP3、ASC和pro-caspase-1可以组装成NLRP3炎性小体。
图5 EST12-RACK1通过NLRP3和GSDMD引起巨噬细胞焦亡和IL-1分泌
A-C：LDH、ELISA分析EST12处理的WT、NLRP3-/-和GSDMD-/-腹腔巨噬细胞毒性分析及IL-1β分泌；D：WB检测EST12处理的WT、NLRP3-/-腹腔巨噬GSDMD和caspase-1的活性；E：WB检测EST12和EST12-Y80A处理的腹腔巨噬细胞GSDMD的活性；F-H：LDH、ELISA、WB检测EST12处理WT和caspase-1/11−/−腹腔巨噬细胞毒性分析、IL-1β分泌及GSDMD的活性；I、J：LDH、ELISA分析H37Rv、H37RvΔEST12及BCG、BCG-EST12感染WT、NLRP3−/−、GSDMD−/−和caspase-1/11−/−BMDMs细胞6小时后细胞毒性和IL-1β分泌。
ST12处理GSDMD−/−或NLRP3−/−小鼠的腹腔巨噬细胞，与WT小鼠腹腔巨噬细胞相比，细胞毒性相比明显下降（图5A、B）；上清中未检测到IL-1β（图5C）；检测EST12对NLRP3−/−腹腔巨噬细胞caspase-1和GSDMD裂解的影响，发现两者均未显示活化作用（图5D）。EST12-Y80A处理WT巨噬细胞未裂解GSDMD（图5E）。IL-1β分泌明显降低（图5F、G），未观察到GSDMD的裂解（图5H），结果表明EST12通过caspase-1引发巨噬细胞GSDMD介导的焦解和IL-1分泌。H37Rv与H37RvΔEST12感染NLRP3−/−、GSDMD−/−、caspase-1/11−/−BMDMs细胞毒性、IL-1β分泌并无差异，除WT BMDMs（图5I）。BCG-EST12和BCG感染也是类似情况。
结果小结：EST12-Y80通过RACK1、NLRP3、GSDMD、caspase-1触发巨噬细胞焦亡和IL-1分泌。
在感染过程中，被感染巨噬细胞的焦亡作用是激活宿主免疫系统的必要条件。构建M.tb H37Rv和H37RvΔEST12小鼠感染模型，感染30天后，进行肺部菌落计数、血清中IL-1β检测及肺部切片抗酸染色（图6A-C）。肺部切片HE染色病理学分析中，H37RvΔEST12感染组相较于H37Rv组，淋巴细胞浸润增多、肺泡间隔变小（图6D）。BCG-EST12相较于BCG感染的小鼠肺部载菌量降低（图6E）、IL-1β分泌增加（图6F），病理分析显示感染BCG组肺泡组织损伤较BCG-EST12组严重（图6G）。对不同细菌感染后的WT BMDMs进行菌落计数，在WT BMDMs中，BCG-EST12感染与BCG组相比，在3和6 hpi时CFUs更少（图6H）。BCG-EST12和BCG感染RACK1−/−,NLRP3−/−,GSDMD−/−和caspase-1/11−−/BMDMs后，菌落计数没有不同（图6I、J）。
结果小结：EST12增加了巨噬细胞和小鼠对M. tb感染抵抗力,它通过RACK1-、NLRP3、GSDMD和caspase-1/11-介导的炎症焦亡在M. tb诱导免疫中扮演关键的角色。
图6 EST12激活宿主免疫反应增加分枝杆菌清除
A：小鼠感染H37Rv、H37RvΔEST12菌株30天后，肺部菌落计数；B：ELISA检测血清中IL-1β；C：H37Rv、H37RvΔEST12感染小鼠肺部切片抗酸染色；D：H37Rv、H37RvΔEST12感染小鼠肺部切片HE染色；E：小鼠感染BCG、BCG-EST12肺部菌落计数；F：ELISA检测血清中IL-1β；G：BCG、BCG-EST12感染小鼠肺部切片HE染色；H-J：WT（H）和RACK1−/−（J） BMDMs感染BCG和BCG-EST12或WT，NLRP3−/−，GSDMD−/−，caspase-1/11−/−BMDMs（I）感染6小时菌落计数。
EST12通过与巨噬细胞RACK1相互作用而引起细胞焦亡。RACK1作为检测M. tb EST12的主要宿主因子，并招募去泛素酶UCHL5促进NLRP3去泛素化，进而激活巨噬细胞NLRP3炎性小体-caspase-1-GSDMD细胞焦亡-IL-1β分子免疫通路。该研究阐释了巨噬细胞与EST12之间的相互作用，并证实了EST12-RACK1诱导的细胞焦亡在M. tb诱导免疫中的关键作用。
文献来源：
https://advances.sciencemag.org/content/6/43/eaba4733
