2020年10月21日,武汉大学章晓联、殷雷老师作为共同通讯作者在 Science Advances 在线发表最新研究成果 “Mycobacterial EST12 activates a RACK1–NLRP3–gasdermin D pyroptosis–IL-1β immune pathway”,该研究鉴定了一种从 M. tb H37Rv 分泌的细胞焦亡诱导蛋白 EST12(Rv1579c)。

晶诺生物为本研究构建了EST12敲除菌株并提供相关技术支持!感谢武汉大学章晓联、殷雷老师研究团队对晶诺生物的信任和大力支持!

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导读:

细胞焦亡是一种程序性细胞死亡的炎性形式,与消除病原体感染有关。该文章介绍了一种诱导巨噬细胞焦亡的结核蛋白EST12。EST12结合巨噬细胞中活化的C激酶1(RACK1)的受体,EST12-RACK1复合体募集去泛素化酶UCHL5来促进NLRP3的K48连接去泛素化,随后导致NLRP3–caspase-1/11–GSDMD–IL-1β免疫过程。EST12晶体结构分析表明,氨基酸Y80是RACK1的关键结合位点。EST12敲除菌株在体内或体外MTB感染中都显示出了高易感性。该研究首次证明了RACK1作为病原体的内源宿主感应蛋白,并且EST12-RACK1诱导的细胞焦亡在M.tb诱导的免疫中起关键作用。

研究内容:
1、RD区编码蛋白筛选:对40种RD区(RD1-3、11-14)重组蛋白进行筛选(巨噬细胞焦磷酸相关蛋白),通过LDH释放实验细胞毒性分析,发现EST12对巨噬细胞有显著焦解作用。
2、菌株构建:构建M. tb H37Rv ΔEST12(Rv1579c敲除菌株)、BCG-EST12(Rv1579c过表达菌株)、M. smeg–EST12(Rv1579c过表达菌株)。
3、小鼠基因敲除模型:NLRP3−/−、GSDMD−/−、caspase-1/11−/−小鼠、RACK1ΔMΦ。4、检测内容:LDH(乳酸脱氢酶)释放实验检测细胞毒性、ELISA检测细胞因子分泌、WB检测、免疫沉淀(IP)、pull down、质谱、EST12晶体结构、共聚焦显微镜、小鼠结核感染模型等。
实验思路:
研究结果:
1、EST12(Rv1579c)诱导GSDMD介导的巨噬细胞焦亡

表达纯化40种RD区编码蛋白,通过LDH释放实验,发现EST12(Rv1579c)具有明显的巨噬细胞毒性作用。EST12蛋白导致小鼠腹腔巨噬细胞(图1A和B)、人单核细胞THP-1(图1C)和小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)死亡(图1D)。结果表明,EST12对巨噬细胞具有较强的毒性。

图1 巨噬细胞焦亡诱导蛋白EST12的鉴定

A-D:分别用EST12和Rv1577处理小鼠腹腔巨噬细胞(A、B)、PMA分化的THP1细胞(C)、小鼠骨髓巨噬细胞BMDMS(D),采用LDH释放法分析。E:WB检测2μM EST12或RV1577处理巨噬细胞GSDMD活化;F:ELISA检测IL-1β分泌;G:WB检测H37Rv和H37RvΔEST12感染BMDMs细胞后caspase-1/GSDMD活性;H:LDH释放实验检测细胞毒性;I:ELISA检测IL-1β分泌;J:WB检测BCG和BCG-EST12感染BMDMs细胞后caspase-1/GSDMD活性;K:LDH释放实验检测细胞毒性,ELISA检测IL-1β分泌。

 

为确定GSDMD和GSDME是否参与EST12诱导的细胞死亡,2μM EST12刺激小鼠腹腔巨噬细胞不同时间,检测GSDMD和GSDME活性。发现2μM EST12刺激小鼠腹腔巨噬细胞0.5小时GSDMD全长、GSDMD N端和C端被检测到,caspase-1 P20片段裂解活性增强(图1E),巨噬细胞IL-1β分泌增加(1F),EST12进一步处理人THP-1单核细胞来源巨噬细胞,发现caspase-1和GSDMD被EST12裂解。

检测H37Rv和H37RvΔEST12感染巨噬细胞caspase-1和GSDMD活性,H37Rv∆EST12组与H37Rv组在感染后1小时内无明显变化。在刺激6h后,H37Rv在BMDMs中诱导了更多裂解的caspase-1 p20和GSDMD-N末端片段(图1G)。与之类似,H37Rv∆EST12组LDH释放和IL-1β分泌低于H37Rv组(图1H、I)。结果表明,H37Rv∆EST12组造成的炎性焦亡少于H37Rv组。在BMDMs中,与BCG相比BCG-EST12持续诱导更多的caspase-1 p20和GSDMD-N末端片段(图1J),细胞毒性和IL-1分泌量更高(图1K)。结果表明,重组BCG-EST12较BCG诱导IL-1β表达量和细胞毒性显著升高。

结果小结:EST12通过GSDMD介导巨噬细胞焦亡和炎性细胞因子IL-1分泌。

2、EST12与RACK1相互作用诱导巨噬细胞炎性焦亡

为检测细胞中与EST12相互作用蛋白,使用pull down实验和质谱检测,结果发现RACK1蛋白可能是与EST12的结合蛋白,免疫印迹进一步验证了这个结果(图2A)。将EST12-绿色荧光和RACK1-红色荧光蛋白表达质粒转染到巨噬细胞RAW264.7中,共聚焦荧光显微镜显示EST12和RACK1在细胞质中定位,产生黄色(图2B)。qPCR和WB分析结果显示,EST12刺激巨噬细胞RACK1的表达,在6h时达到峰值,然后下降(图2C),推测EST12在早期促进RACK1的表达。

图2 EST12与RACK1相互作用诱导巨噬细胞炎性焦亡

A:RAW264.7细胞进行EST12-His pull-down实验,WB分析;B:共聚焦显微镜分析分别转染pEGFP-C1-EST12和pAsRED2-C1-RACK1的RAW264.7细胞;C:WB和qPCR分析2μM EST12刺激的RAW264.7细胞;D、E:LDH、ELISA分析2μM EST12处理WT和RACK1−/−腹腔巨噬细胞上清;F:WB检测细胞裂解液中GSDMD和caspase-1;G:2μM EST12处理和PI染色WT、RACK1−/−巨噬细胞;E-J:LDH、ELISA分析H37Rv和H37RvΔEST12、BCG和BCG-EST12、M. smegM. smeg-EST12感染WT、RACK1−/−BMDMs。

 

研究EST12与RACK1在巨噬细胞中相互作用,2μM EST12分别刺激WT和RACK1−/−腹腔巨噬细胞,与WT巨噬细胞相比,RACK1−/−腹腔巨噬细胞中EST12诱导的细胞毒性(图2D)和IL-1分泌(图2E)显著降低,GSDMD N片段和caspase-1 p10裂解被强烈抑制(图2F)。实时共焦显微镜分析显示,EST12导致腹腔巨噬细胞呈现典型的细胞焦亡形态:质膜破裂,多个泡状突起,细胞核内呈“煎蛋”状(图2G)。H37RvΔEST12感染WT BMDMs和H37Rv感染RACK1−/−BMDMs的细胞凋亡和IL-1β分泌无区别(图2H)。BCG-EST12和BCG感染RACK1−/−BMDMs的细胞毒性和IL-1β分泌无明显区别(图2I)。M. smegM. smeg-EST12实验组也是同样结果(图2J)。

结果小结:EST12通过RACK1引起巨噬细胞炎性焦亡。

3、EST12蛋白C端和Y80是与RACK1结合的关键位点

对EST12-RACK1结构预测(图3B),EST12与RACK1的相互作用可能依赖于EST12的第三个螺旋状结构(E55、F76、Y80)。重组蛋白(图3C)对RAW264.7细胞裂解物进行pull down实验,然后免疫印迹分析,与EST12和EST12-D2蛋白相比,EST12-D1(C端缺失)与RACK1几乎没有相互作用(图3D),Y80A和F76A与RACK1的结合作用明显低于EST12(图3E)。与EST12相比,EST12-D1的细胞毒性作用也明显减弱(图3F、G),EST12-E55A、F76A、Y80A诱导的细胞毒性作用下降,其中EST12-Y80A最为明显(图3H、I)。同样,M. smeg-EST1-D1和M. smeg-EST12-Y80A感染引起的细胞焦亡较M. smeg-EST12减少(图3J、K)。

结果小结:EST12 C端的Y80是RACK1引起焦亡的关键结合位点。

图3 Y80是RACK1的关键结合位点

A:EST12晶体结构;B:EST12-RACK1预测结构;C:重组蛋白全长、EST12 C端缺失(EST12- D1)、N端缺失(EST12- D2)、EST12的3个突变体图示;D-E:重组蛋白pull down及WB分析;F-I:LDH分析重组蛋白不同时间、不同剂量处理腹腔巨噬细胞;J-K:LDH分析M. smeg和M. smeg-est12、EST12-D1、EST12-D2、EST12-E55A、EST12-F76A、EST12-Y80A感染BMDMs。

 

4、EST12-RACK1通过NLRP3和GSDMD引起巨噬细胞焦亡和IL-1分泌

炎症小体的激活是对抗细菌感染的关键防御机制,细菌感染可诱发先天性免疫反应,如caspase-1激活和炎症细胞死亡。mRNA芯片分析EST12处理RAW264.7细胞,结果显示NLRP3、IL-1β、IL-6和TNF-α表达上调。8个PYRIN结构域蛋白(NLRP1b、NLRP2、NLRP3、NLRP5、NLRP6、NLRP9、NLRP12、PYRIN)通过EST12处理后,NLRP3的mRNA表达在巨噬细胞显著改变(图4A)。在EST12刺激6小时后,免疫印迹分析NLRP3蛋白表达上升达到最高(图4B)。共聚焦显微镜分析显示,NLRP3表达在EST12刺激后6小时最高(图4C)。EST12处理后,RACK1−/−中NLRP3表达明显受损(图4D)。

结果小结:EST12导致NLRP3的表达依赖于RACK1。

 

图4 EST12通过RACK1诱导NLRP3炎症小体的激活

 A:qPCR分析EST12蛋白处理的小鼠腹腔巨噬细胞8个PYRIN结构域蛋白的mRNA表达水平;B-C:WB和共聚焦显微镜检测EST12蛋白刺激的RAW264.7细胞;D:qPCR分析EST12处理WT和RACK1−/−腹腔巨噬细胞的NLRP3 mRNA表达水平;E:IP和WB分析质粒转染后EST12刺激的RAW264.7细胞;F:WB分析裂解的BMDMs细胞的pull down蛋白;G-J:IP和WB分析EST12处理的BMDMs细胞;K:共聚焦显微镜分析EST12处理后的WT和RACK1−/−腹腔巨噬细胞;L:IP和IB分析EST12处理或未预处理的腹腔巨噬细胞。

 

将编码WT泛素(H-Ub)、突变H-Ub(K48)和H-Ub(K63)质粒转染至RAW264.7细胞,通过IP和WB实验,推测EST12介导了K48连接的NLRP3去泛素化(图4E)。WB分析EST12处理的RAW 264.7细胞裂解液pull down蛋白,进一步验证EST12和去泛素酶UCHL5的相互作用(图4F)。通过免疫共沉淀分析,发现在EST12处理后,NLRP3和RACK1均直接与UCHL5相互作用(图4,G-I),而EST12-Y80A处理不能促进RACK1与UCHL5、NLRP3的相互作用(图4,H和I)。UCHL5敲低株在EST12刺激后,NLRP3的K48去泛素化明显降低(图4J),结果表明EST12刺激后通过UCHL5介导NLRP3 K48连接的去泛素化。免疫荧光分析发现EST12存在时ASC斑点的形成,但在EST12处理的RACK1−/−腹腔巨噬细胞中却没有发现(图4K)。IP和WB实验发现NLRP3可以同时沉淀ASC和pro-caspase-1,ASC也可以沉淀NLRP3和pro-caspase-1(图4L)。

结果小结:在EST12处理后,NLRP3、ASC和pro-caspase-1可以组装成NLRP3炎性小体。

 

图5 EST12-RACK1通过NLRP3和GSDMD引起巨噬细胞焦亡和IL-1分泌

A-C:LDH、ELISA分析EST12处理的WT、NLRP3-/-和GSDMD-/-腹腔巨噬细胞毒性分析及IL-1β分泌;D:WB检测EST12处理的WT、NLRP3-/-腹腔巨噬GSDMD和caspase-1的活性;E:WB检测EST12和EST12-Y80A处理的腹腔巨噬细胞GSDMD的活性;F-H:LDH、ELISA、WB检测EST12处理WT和caspase-1/11−/−腹腔巨噬细胞毒性分析、IL-1β分泌及GSDMD的活性;I、J:LDH、ELISA分析H37Rv、H37RvΔEST12及BCG、BCG-EST12感染WT、NLRP3−/−、GSDMD−/−和caspase-1/11−/−BMDMs细胞6小时后细胞毒性和IL-1β分泌。

 

ST12处理GSDMD−/−或NLRP3−/−小鼠的腹腔巨噬细胞,与WT小鼠腹腔巨噬细胞相比,细胞毒性相比明显下降(图5A、B);上清中未检测到IL-1β(图5C);检测EST12对NLRP3−/−腹腔巨噬细胞caspase-1和GSDMD裂解的影响,发现两者均未显示活化作用(图5D)。EST12-Y80A处理WT巨噬细胞未裂解GSDMD(图5E)。IL-1β分泌明显降低(图5F、G),未观察到GSDMD的裂解(图5H),结果表明EST12通过caspase-1引发巨噬细胞GSDMD介导的焦解和IL-1分泌。H37Rv与H37RvΔEST12感染NLRP3−/−、GSDMD−/−、caspase-1/11−/−BMDMs细胞毒性、IL-1β分泌并无差异,除WT BMDMs(图5I)。BCG-EST12和BCG感染也是类似情况。

结果小结:EST12-Y80通过RACK1、NLRP3、GSDMD、caspase-1触发巨噬细胞焦亡和IL-1分泌。

 

5、EST12激活宿主免疫反应,增强分枝杆菌清除

在感染过程中,被感染巨噬细胞的焦亡作用是激活宿主免疫系统的必要条件。构建M.tb H37Rv和H37RvΔEST12小鼠感染模型,感染30天后,进行肺部菌落计数、血清中IL-1β检测及肺部切片抗酸染色(图6A-C)。肺部切片HE染色病理学分析中,H37RvΔEST12感染组相较于H37Rv组,淋巴细胞浸润增多、肺泡间隔变小(图6D)。BCG-EST12相较于BCG感染的小鼠肺部载菌量降低(图6E)、IL-1β分泌增加(图6F),病理分析显示感染BCG组肺泡组织损伤较BCG-EST12组严重(图6G)。对不同细菌感染后的WT BMDMs进行菌落计数,在WT BMDMs中,BCG-EST12感染与BCG组相比,在3和6 hpi时CFUs更少(图6H)。BCG-EST12和BCG感染RACK1−/−,NLRP3−/−,GSDMD−/−和caspase-1/11−−/BMDMs后,菌落计数没有不同(图6I、J)。

结果小结:EST12增加了巨噬细胞和小鼠对M. tb感染抵抗力,它通过RACK1-、NLRP3、GSDMD和caspase-1/11-介导的炎症焦亡在M. tb诱导免疫中扮演关键的角色。

 

图6 EST12激活宿主免疫反应增加分枝杆菌清除

A:小鼠感染H37Rv、H37RvΔEST12菌株30天后,肺部菌落计数;B:ELISA检测血清中IL-1β;C:H37Rv、H37RvΔEST12感染小鼠肺部切片抗酸染色;D:H37Rv、H37RvΔEST12感染小鼠肺部切片HE染色;E:小鼠感染BCG、BCG-EST12肺部菌落计数;F:ELISA检测血清中IL-1β;G:BCG、BCG-EST12感染小鼠肺部切片HE染色;H-J:WT(H)和RACK1−/−(J) BMDMs感染BCG和BCG-EST12或WT,NLRP3−/−,GSDMD−/−,caspase-1/11−/−BMDMs(I)感染6小时菌落计数。

 

结论:

EST12通过与巨噬细胞RACK1相互作用而引起细胞焦亡。RACK1作为检测M. tb EST12的主要宿主因子,并招募去泛素酶UCHL5促进NLRP3去泛素化,进而激活巨噬细胞NLRP3炎性小体-caspase-1-GSDMD细胞焦亡-IL-1β分子免疫通路。该研究阐释了巨噬细胞与EST12之间的相互作用,并证实了EST12-RACK1诱导的细胞焦亡在M. tb诱导免疫中的关键作用。

 

文献来源:

https://advances.sciencemag.org/content/6/43/eaba4733

 

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