非结核分枝杆菌(NTM)是指除MTB复合群和麻风分枝杆菌以外的一大类分枝杆菌总称,是一种环境生长菌,在自然界广泛存在。目前全世界已发现NTM 190余种,但只有少数是致病菌,属于条件致病菌,主要侵犯肺部。近年来国内NTM发病率不断增加,以鸟复合分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和蟾蜍分枝杆菌最为常见。随着分子生物学的发展,不断有新的菌种被发现、亲缘关系密切的菌种被鉴定出来,使得NTM菌种分类更加细化和完善。

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菌种鉴定的目的是对NTM病进行精准诊断,包括对NTM临床相关性的判定,同时由于不同菌种对药物的敏感性不同,菌种鉴定对治疗方案的制定也具有重要价值。临床最常见的快速生长分枝杆菌包括脓肿分枝杆菌、偶然分枝杆菌和龟分枝杆菌,感染通常选用大环内酯类、氨基糖苷类和氟喹诺酮类等药物治疗。最常见的慢生长分枝杆菌包括鸟分枝杆菌复合群(MAC,主要包括鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌)、堪萨斯分枝杆菌及蟾蜍分枝杆菌等,治疗通常选取大环内酯类和利福霉素类药物,有时候加用注射类抗结核药物。

目前常用商业化菌种鉴定试剂盒对NTM进行菌种鉴定,具有操作相对简单、在医疗机构可独立完成且能够满足临床基本需求的优点,但由于纳入菌种数量有限,无法完全覆盖NTM高流行地区实际分离到的菌种类型,容易导致鉴定失败或错误。而全基因组测序技术可以弥补并很好地解决此方面问题,因其具有较高的灵敏度及强大的鉴别能力,尤其是在无法获得可能感染病原体线索的情况下优势更为明显,故临床应用越来越多。

晶诺生物针对NTM菌种鉴定已经建立完善的实验和数据分析平台。NTM分析服务从基因组提取开始,针对分枝杆菌的基因组特征,建立了针对性、标准化的基因组提取和质控评估平台;基于Illumina测序平台获得高通量测序数据,对测序结果进行拼接获得基因组草图,通过与NTM参考基因组进行Pairwise基因组核酸相似度(gANI)分析。数据分析中以95%的相似度为阈值进行分枝杆菌物种判定,同时可根据相似度矩阵构建系统发育树,分析种间及种内群体多样性。

接着为您介绍一下晶诺生物NTM测序的质控及分析平台:

 

一、质控平台

为了从源头上保证测序数据的准确性、可靠性,对样品提取、DNA检测、建库、测序每一个生产步骤都严格把控,从源头上确保了高质量数据的产出。

1、DNA提取:

基因组提取我们采用改良版的CTAB法,由经验丰富的专业人员处理,以保证DNA的高质量。

2、建库前质控:

使用Qubit荧光光度计、琼脂糖凝胶电泳或Agilent 5400对DNA的纯度、完整性及浓度进行精确检测,样本合格后建库。

3、文库及测序数据质控:
文库构建完成后,先使用Qubit 2.0进行初步定量,稀释文库,随后使用Agilent 2100对文库的插入片段进行检测,插入片段大小符合预期后,使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量分析,多个环节并重以保证文库质量。文库检测合格后,按照有效浓度及目标下机数据量的需求将不同文库pooling至flowcell,cBOT成簇后使用Illumina高通量测序平台NovaSeq 6000进行测序,原始数据量产出1G以上。

 

二、NTM分析内容

1、非结核分枝杆菌物种鉴定(流程如下)

 

物种鉴定结果示例:

以95%的相似度为阈值进行分枝杆菌物种判定,同时也可分析出相应的亚种。

 

2、系统进化树

NTM样本系统进化树示例:

根据相似度矩阵构建系统发育树,分析种间及种内群体多样性。

NTM常规分析结果交付内容:测序原始数据、拼接数据、NTM鉴定结果(excel)、系统进化树。

 

3、高级分析*

(1)分枝杆菌毒力基因分析:通过同源性比对分析分枝杆菌毒力相关基因在测序菌株中的情况,并进行聚类分析。

(2)细胞壁重要脂质成分合成基因簇分析:细胞壁脂质是分枝杆菌致病性的重要因子,根据相关合成基因的分布情况,评估测序菌株细胞壁脂质情况。

除以上分析,我们还可以提供对菌种鉴定后的突变信息分析,可分析出对比参考基因组的基因突变情况,导出基因突变信息(SNP、插入缺失小片段)。

*基础分析不包含高级分析

 

欢迎感兴趣的老师前来咨询哦!

 

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