文库制备方法、测序和生物信息学分析技术发展迅速,且成本逐渐减低,为二代测序应用于病原菌感染性疾病诊断和分子流行病学分析带来了革命性的进展。

随着测序技术的日益成熟和生物信息学的发展,全基因组测序和分析已被广泛应用于结核分枝杆菌的分子检测(早期辅助诊断)、抗结核药物敏感性的预测(指导临床用药和制定科学的治疗方案),以及对地区传播模式的分子流行病学研究(有助于发现和控制疫情)中,为解决结核病的早期诊断和耐药问题,以及有效控制疫情传播提供了很大的帮助。

晶诺专业致力于结核病相关的基础和应用研究。针对结核分枝杆菌的基因组特征,建立了针对性、标准化的基因组提取和质控评估平台,已有几万株结核分枝杆菌基因组数据生物信息学分析经验。

下面详细介绍一下晶诺的结核测序、分析平台:

一、质控评估平台

为了从源头上保证测序数据的准确性、可靠性,对样品提取、DNA检测、建库、测序每一个生产步骤都严格把控,从源头上确保了高质量数据的产出。

(1)DNA提取:

基因组提取我们采用改良版的CTAB法,由经验丰富的专业人员处理,以保证DNA的高质量。

(2)建库前质控:

使用Agilent 5400对DNA的纯度、完整性及浓度进行精确检测,样本合格后建库。

DNA完整性检测

(3)文库及测序数据质控:
文库构建完成后,先使用Qubit 2.0进行初步定量,稀释文库,随后使用Agilent 2100对文库的插入片段进行检测,插入片段大小符合预期后,使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量分析,多个环节并重以保证文库质量。文库检测合格后,按照有效浓度及目标下机数据量的需求将不同文库pooling至flowcell,cBOT成簇后使用illumina高通量测序平台NovaSeq 6000进行测序,原始数据量产出1G以上,测序平均深度可达200X以上。

二、结核菌全基因组测序数据分析平台

(1)耐药分析

基因型预测是基于异烟肼(ahpCinhAfabG1katG)、利福平(rpoB)、乙胺丁醇(embAembBembC)和吡嗪酰胺(pncA)等耐药性相关基因内或上游的突变。根据已知的结核耐药突变数据库,预测结核分枝杆菌对常用抗结核药物(异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、链霉素、氟喹诺酮、氨基糖苷类、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素、乙硫异烟胺、对氨基水杨酸、环丝氨酸、利奈唑胺、贝达喹啉、氯法齐明、迪拉马尼)的敏感性,全基因组测序涵盖的基因组位点数量几乎不受限制,但可能无法检测到具有复杂基础基因相互作用的耐药机制。

耐药分析示例:

图1

图2

图1给出了样本菌株的谱系、敏感、耐多药或广泛耐药,以及对应药物耐药的突变点信息,其中-为未发现已知对应的药物耐药基因型。图2为耐药基因的突变频率,突变点在样本中可能有些菌株突变、有些未突变。

注:lineage1为环印度洋分枝、lineage2为东亚分枝(北京系)、lineage3为中亚东非印度分枝、lineage4为欧美分枝、lineage5和lineage6为主要流行于西非的非洲分枝,M. africanum West Africa 1 和 M. africanum West Africa 2、Lineage7 埃塞俄比亚分枝。

(2)遗传距离分析——近期传播关系

传统分子流行病学方法一般使用IS6110 RFLP、spoligotype、VNTR等基因分型方法鉴定结核病传播链,但使用全基因组测序的方法相较于基因分型具有更多的优势,如全基因组测序具有更高的分辨率,全基因组测序是基于基因组间的SNP差异数来确定两两菌株间是否具有近期传播关系,而传统基因分型只是基于部分基因进行区分,结果可能造成基因型相同的菌株存在不同的传播源和传播路径。另一方面,传统基因分型很难准确鉴别传播发生的路径、顺序及是否存在多个传播源,而通过全基因组数据分析可解决此类问题。

遗传距离分析示例:


该图为每两个菌株间的SNP差异数矩阵,一般认为SNP<12个,两菌株间具有近期传播关系,可结合流行病学调查鉴定地区结核病的传播链。

此项分析在流行病学调查研究中更具有明显优势,随着高通量测序的普遍应用及成本优势,有望取代传统的基因分型方法,成为分子流行病学的金标准。

除了以上常规分析内容,晶诺新增个性化分析内容——构建系统发育树,并将以上的数据内容进行汇总图形化显示,更清晰区分各菌株间关系、药物的敏感性、谱系及耐药分类。

系统进化树示例:


图中线长短用于表示两个菌株间的遗传距离,谱系、耐药分类使用颜色进行了区分,药物敏感性使用了空实圈进行标注,黑色圆圈表示耐受对应药物,白色圆圈表示对应药物敏感。

除此之外,也可定制其它高级分析内容,如结核分枝杆菌的传播方向分析等内容,欢迎咨询!

根据全基因组测序将成簇菌株进行传播方向分析,将某菌株的交叉节点设定为其他簇菌株的祖先节点,从祖先节点到各菌株节点的方向即为菌株进化及最可能的传播方向。

 

测序样本送样标准

1、固体培养需刮取绿豆大小菌量置于500 uL TE buffer(避免降解)中80℃高温灭活30 min。

2、刮取固体菌时注意尽量避免带有琼脂。

3、液体培养需收集108以上菌量,离心后菌体置于500 uL TE buffer(避免降解)中80℃高温灭活30 min。

4、菌液最好为新鲜培养,避免影响提取效果。

5、DNA样本要求,总量大于200 ng,浓度大于10 ng/uL,主条带完整,无RNA污染。

注:需低温运输,最好干冰运输;尽量多提供些菌量,避免补样。

 

最后和大家分享一下有关结核分枝杆菌全基因组测序分方面的综述文章,希望能对结核基因组测序感兴趣的同行有所帮助。

 

文献分享:

1、张洁,任怡宣,潘丽萍,张宗德.全基因组测序在结核分枝杆菌研究中的应用[J].中国防痨杂志,2020年7月第42卷第7期.

链接:http://www.zgflzz.cn/CN/10.3969/j.issn.1000-6621.2020.07.017

2、徐鹏,甘明宇,高谦.二代测序技术在结核分枝杆菌研究中的应用进展[J].微生物与感染,2015年2月25日,10(1):54-60.

链接:http://jmi.fudan.edu.cn/CN/abstract/abstract491.shtml