一、研究背景
结核分枝杆菌感染巨噬细胞后巨噬细胞会产生NO。NO是对抗结核分枝杆菌的重要分子，高浓度的NO可杀死结核分枝杆菌，低浓度的NO促使结核分枝杆菌处于潜伏感染，临床上也发现结核病患者呼吸产生的气体中NO含量减少不利于结核病的治疗。然而，结核分枝杆菌可通过分泌定位到巨噬细胞细胞核的PPE2蛋白来抑制NO的生成[1]。结核分枝杆菌受到巨噬细胞NO胁迫时PPE2蛋白表达量增多，NO如何影响该过程目前还不清楚[2]。
White B-like（Wbl）蛋白是感知NO的重要蛋白家族，存在于放线菌、结核分枝杆菌等多种细菌中，该蛋白家族成员在N端有4个保守的半胱氨酸残基、C端有DNA结合区。结核分枝杆菌编码7种Wbl蛋白分别是WhiB1、WhiB2、WhiB3、WhiB4、WhiB5、WhiB6、WhiB7。WhiB1蛋白，在N端有感知NO的Fe-S簇，Fe-S簇对WhiB1蛋白与转录调控蛋白σA的结合至关重要。结核分枝杆菌感受到NO后，WhiB1：σA复合体会发生解离，WhiB1、σA进而可调控其他基因的转录[3]。NO影响结核分枝杆菌PPE2的表达，说明WhiB1、σA可能参与PPE2的转录调控。
Fig1. WhiB1蛋白结构
PPE2蛋白属于PE、PPE蛋白家族成员，该蛋白家族成员在其蛋白N端富含脯氨酸、谷氨酸，根据蛋白C端氨基酸序列不同又可细分为PE、PE_PGRS、PPE、PPE-SVP等。许多PE、PPE蛋白家族成员如PPE36、PPE68、PE_PGRS33、PE_PGRS63、PPE_MPTR34等定位在结核分枝杆菌细胞壁上，这些蛋白的分泌离不开结核分枝杆菌的ESX分泌系统[4,5]。PPE2蛋白能定位到巨噬细胞细胞核，说明PPE2蛋白是分泌蛋白，其分泌依赖的ESX分泌系统有待深入研究。
Fig2. PPE2基因在结核分枝杆菌基因组的位置
Fig3. ESX分泌系统参与PE、PPE蛋白家族成员转运
Jonathan Braverman等发现NO能作为信号分子抑制NF-kB，抑制炎症因子的生成，可能是IFN-γ发挥抗结核功能的机理之一[6]。PPE2抑制NO生成，可能会导致NF-kB的活化及炎症因子的产生。NF-kB信号通路、炎症因子在结核分枝杆菌感染巨噬细胞及结核分枝杆菌命运中究竟发挥何种功能仍需探讨。
二、相关研究
1、NO促进结核分枝杆菌PPE2蛋白表达，PPE2定位于巨噬细胞细胞核并抑制NO生成
病原菌感染细胞后能被巨噬细胞产生的活性氧、活性氮等杀死，然而结核分枝杆菌能通过调控巨噬细胞活性氮的生成而逃脱被巨噬细胞杀死的命运。
结核分枝杆菌PPE2蛋白在NO胁迫或感染巨噬细胞后表达量升高，表明PPE2可能参与调控巨噬细胞NO生成过程，但是具体机制尚不清楚。NCBI蛋白结构保守域数据库显示PPE2可能是COG5651类蛋白，参与细胞运动和分泌。
Khalid Hussain Bhat等人通过比对PPE家组蛋白序列，发现PPE2蛋白C端473-481位置有核定位信号序列，同时在319-340位置处有亮氨酸拉链结构，这与真核细胞转录因子结构类似，表明PPE2蛋白可能定位到巨噬细胞细胞核并调控inos转录。在此理论假设前提下，Khalid Hussain Bhat等以M. smegmatis为研究对象，构建了M. smegmatis pEGFP-PPE2、pEGFP-∆NLS-PPE2等过表达菌株并感染巨噬细胞，发现PPE2蛋白定位于巨噬细胞细胞核并能下调巨噬细胞NO的生成，证明了假设的准确性[1]。PPE2蛋白分泌需要ESX分泌系统，但是其分泌机制还有待深入研究。目前还没有PPE2在Mycobacterium tuberculosis H37Rv中的研究报道。☜感兴趣的朋友可以趁早下手
Fig4. PPE2蛋白定位于巨噬细胞细胞核
Fig5. PPE2蛋白能下调iNOS的转录及表达
2、WhiB1蛋白结合NO研究
Bassam K. Kudhair等人体外纯化了WhiB1蛋白，质谱实验表明WhiB1蛋白存在apo-WhiB1、不同Fe-S原子数目的WhiB1、WhiB1[4Fe-4S]等多种形式，其中WhiB1[4Fe-4S]最多，S原子的丢失可能是WhiB1蛋白启动降解过程的原因，相关机制、参与的酶还不清楚；另外，研究人员在大肠杆菌中共表达了WhiB1、σA，发现二者能够结合；NO处理WhiB1：σA复合体后，二者发生分离并释放apo-WhiB1，证明NO能与WhiB1 Fe-S结合[3]。
Fig6. NO导致WhiB1：σA复合体分离
研究人员还做了WhiB1基因突变菌株，WhiB1表达量与对照组相比降低了2.7倍，测定转录情况后发现有35个基因转录发生了比较明显的变化，这些基因包括12个假定蛋白、9个脂类代谢相关蛋白、3个转运蛋白、5个中间产物代谢或电子传递链相关蛋白、1个转座酶等。WhiB1突变对ESX-1分泌相关蛋白转录影响最为明显，另外还影响了PE、PPE蛋白家族的lipX基因（Rv1169c）[3]，这些蛋白都是结核分枝杆菌基础研究中的热点蛋白。
Fig7. WhiB1突变对结核分枝杆菌相关基因的转录影响
三、研究方案
1、WhiB蛋白基因敲除或过表达对结核分枝杆菌PPE2基因表达的影响
结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis H37Rv WhiB 蛋白家族共有WhiB1-WhiB7七个蛋白，这些蛋白都能与NO结合。
A. 构建结核分枝杆菌whiB1-whiB7 七个基因中的单个基因敲除或过表达菌株（研究显示whiB1为必需基因，敲除有难度）；
B. 基因敲除或过表达菌株体外培养，提取mRNA，逆转录PCR测定PPE2转录情况；提取蛋白，western blot验证PPE2表达情况；测定体外生长曲线；
C. 基因敲除或过表达菌株感染巨噬细胞，观测PPE2巨噬细胞细胞核定位情况；测定菌体内生长曲线、巨噬细胞凋亡、炎症因子释放、NO生成量等。
2、σA基因敲除对结核分枝杆菌PPE2基因表达的影响
A. 构建结核分枝杆菌σA基因敲除或过表达菌株（研究显示σA为必需基因，敲除有难度）；
B. 基因敲除或过表达菌株体外培养，提取mRNA，逆转录PCR测定PPE2转录情况；提取蛋白，western blot验证PPE2表达情况；测定体外生长曲线；
C. 基因敲除或过表达菌株感染巨噬细胞，观测PPE2巨噬细胞细胞核定位情况；测定菌体内生长曲线、巨噬细胞凋亡、炎症因子释放、NO生成量等。
3、结核分枝杆菌WhiB蛋白相关结合蛋白研究
A. 大肠杆菌表达纯化WhiB1-WhiB7蛋白中的一种蛋白并对蛋白进行荧光标记；
B. 荧光标记的目的蛋白与结核分枝杆菌蛋白芯片孵育、清洗后，芯片扫描仪解读芯片数据，设置合适cutoff，潜在蛋白进行数据处理并进行GO分析、pathway分析；
C. 敲除筛到的结核分枝杆菌基因，体外培养测定生长曲线、与WhiB结合等；感染巨噬细胞，测定菌体内生长曲线、巨噬细胞凋亡、炎症因子释放、NO生成量等。
以上方案仅供参考，若想进一步了解，请联系我们。
