结核分枝杆菌毒力基因研究
研究动态

结核分枝杆菌毒力基因研究

对结核分枝杆菌致病机制的研究一直是世界范围关注的热点。结核分枝杆菌4000多个基因中有多少基因/蛋白和致病相关？哪些蛋白质是关键的致病因子？关键致病因子又是如何发挥作用？研究毒力基因对了解结核分枝杆菌致病机制、病菌与宿主之间的相互关系等至关重要，对更好诊断结核、研发新药、新疫苗都有推动作用。

今天小编就和各位老师一起学习几篇重要毒力基因研究的文章，总结一下典型毒力基因研究的套路。

文献1：ppe38基因缺失导致结核分枝杆菌毒力增强

一、研究思路

1.目的基因选择：北京型菌株SAWC_2135与SAWC_2088相比ppe38缺失，毒力明显增强，毒力增强是否由ppe38缺失所引起？

2.突变菌株的构建：构建SAWC_2135 pMV-ppe38-71回补菌株，比较分析SAWC_2088、SAWC_2135与SAWC_2135::pMV-ppe38-71回补重组菌株的毒性；为进一步验证，以CDC1551为出发菌株，构建ppe38位点缺失突变菌株∆ppe38-71及回补菌株∆ppe38-71-C，比较分析毒性差异。

3.结核分枝杆菌突变菌株体内毒性分析：小鼠实验，测定肺部菌载量、肺部炎症和小鼠存活率。

注：ppe38上游基因包含esxG、esxH、ppe71。CDC1551为结核分枝杆菌临床分离菌株，SAWC_2088、SAWC_2135、SAWC_2701为北京型结核分枝杆菌临床分离菌株，其中SAWC_2088为中等毒性菌株，ppe38位点中插入了IS6110位点；SAWC_2135为高毒性菌株，ppe38位点缺失突变菌株，其中esxX、esxY两个基因缺失，ppe38、ppe71两个基因部分缺失。∆ppe38-71突变菌株是将基因ppe38、esxX、esxY、ppe71全部敲除所得到的基因敲除菌株。

二、主要实验内容和结果

a: SAWC_2088、SAWC_2135、SAWC_2135-C感染小鼠存活率

b: SAWC_2088、SAWC_2135、SAWC_2135-C感染小鼠细菌肺负担

c: CDC1551、∆ppe38-71、∆ppe38-71-C感染小鼠存活率

d: CDC1551、∆ppe38-71、∆ppe38-71-C感染小鼠细菌肺负担

分别用菌株SAWC_2088、SAWC_2135及 SAWC_2135::pMV-ppe38-71回补重组菌株感染小鼠，结果见图a、b。SAWC_2088菌株在感染的前14天肺部细菌载量随感染时间增加而增加，之后肺部细菌载量趋于稳定或有所减少。这种较低的肺部菌载量对应较低的死亡率，在感染130天后，78%小鼠存活。高毒力菌株SAWC_2135感染小鼠14天后，肺部细菌载量明显高于SAWC_2088，且随感染时间进一步增高，感染28天后达到最高值。相应地致死率也明显高于SAWC_2088。将ppe38-71回补进SAWC_2135后，回补株和SAWC_2135相比，菌载量和致死率都大幅度降低。结果表明ppe38位点的缺失增进SAWC_2135菌株在体内的生长能力，致病性更强。

为进一步验证以上结论，以中毒性菌株CDC1551为出发菌株，构建ppe38位点缺失突变菌株∆ppe38-71及回补菌株∆ppe38-71-C，分别感染小鼠，结果见图c、d。感染后60天时，位点缺失突变菌株的细菌载量比野生型和回补株高10倍以上，相应地肺部炎症更为严重（如下图所示）。63%感染野生型CDC1551的小鼠可以存活到感染后130天，而所有感染Δppe38-71的小鼠在感染121天时全部死亡，回补株在感染130天时存活率可达95%。从而可以得出结论：ppe38缺失对分枝杆菌的毒力有显著影响，增加了菌体的体内生长速度和存活能力，增强肺部炎症，使菌体具有更高的致病性和致死率。

肺部炎症分析

文献2：ESX-3 系统各组成基因与结核分枝杆菌毒力

一、研究思路

1. 目的基因选择：ESX-3系统各组成基因。

2. 突变菌株的构建：基因敲除菌株∆esx-3、∆esx-G、∆esx-H、∆pe5-ppe4、ΔmbtB的构建，以及回补菌株∆esx-3::esx-3TB、∆esxH::esxGH、∆pe5-ppe4::pe5-ppe4的构建，进一步揭示ESX-3系统各组成基因与结核毒力的相关性。

3. 结核分枝杆菌突变菌株体内毒性分析：小鼠实验，测定小鼠存活率及小鼠各器官细菌载量。

注：ESX-3系统组成基因有：Rv0282-Rv0292，∆esx-3为完整基因簇敲除菌株、∆esx-G为Rv0287基因敲除菌株、∆esx-H为Rv0288基因敲除菌株、∆pe5-ppe4为Rv0285-Rv0286基因敲除菌株、ΔmbtB是Rv2383c基因敲除菌株。

二、主要实验内容和结果

小鼠分别注射结核分枝杆菌H37Rv及∆esx-3突变菌株，剂量为104cfu和107cfu，结果见图A。注射结核分枝杆菌H37Rv的小鼠在感染40天后全部死亡，而注射了突变菌株∆esx-3的小鼠全部存活，可见∆esx-3突变菌株的毒力减弱。

为进一步揭示ESX-3系统各组成基因中哪些是关键的毒力基因，小鼠分别注射结核分枝杆菌H37Rv、ΔmbtB、∆esx-3、∆esx-3::esx-3TB、∆esxH、∆esxH::esxGH、∆pe5–ppe4、∆pe5-ppe4::pe5-ppe4，结果见图B。感染H37Rv的小鼠平均生存时间为22天，感染突变菌株∆pe5-ppe4、∆mbtB的小鼠平均生存时间为27天，感染突变菌株∆esx-H的小鼠平均生存时间为65天。感染突变菌株∆esx-3的小鼠全部存活，而esx-3基因的回补株∆esx-3::esx-3TB平均生存时间为19天，表现为高毒。可见，突变菌株Δpe5-ppe4、ΔmbtB在体内只是轻微的减毒，而突变菌株∆esxH毒力大大降低，表明ESX-3系统中esxH可能是高毒力因子。

用结核分枝杆菌H37Rv、∆esx-3、∆esx-3::esx-3TB分别用喷雾法感染小鼠，结果见图A、B。相比于H37Rv，∆esx-3突变菌株感染小鼠后，肺中未见细菌增殖，也未能扩散到脾脏，毒力大大降低。而回补菌株∆esx-3::esx-3TB则与H37Rv类似表现为高毒。同样，突变株∆esxH也未见肺中增殖，而相应基因回补后则毒力明显恢复。突变菌株∆esx-3、∆esxH在小鼠体内均毒力明显衰减，与突变菌株Δpe5-ppe4、ΔmbtB形成明显对比（图C、D）。进一步证明，ESX-3系统中的PE5-PPE4和mbtB只和细菌毒力弱相关，而EsxH的分泌对毒力则至关重要，是关键的毒力因子。

文献3：毒力因子PE_PGRS62蛋白的功能研究

一、研究思路

1. 目的基因选择：PE_PGRS62基因，旨在研究在耻垢分枝杆菌中过表达PE_PGRS62基因对耻垢分枝杆菌毒力的影响。

2. 突变菌株构建：过表达重组菌株Ms_PE_PGRS62及对照菌株Ms_Vec的构建。

3. 耻垢分枝杆菌突变菌株细胞毒性分析：细胞实验，检测宿主细胞内菌株存活数量、细胞因子表达差异、宿主凋亡及对细胞免疫应答的影响。

注：耻垢是天然缺乏PE_PGRS基因的非致病菌。

二、实验内容

检测巨噬细胞内耻垢分枝杆菌存活数量，结果见图a、b。与Ms_Vec对照菌株相比，过表达PE_PGRS62的耻垢分枝杆菌在巨噬细胞内的存活率得到了提高。

细胞因子表达差异检测：通过RT-PCR检测细胞因子表达量差异，结果见图a-e。IL- 6和IL-1β的表达严重被抑制；IL-12 p40和肿瘤坏死因子α的表达量降低；IL-10的表达量升高。结果表明，细胞因子表达谱的紊乱可能与PE_PGRS62增强巨噬细胞内耻垢分枝杆菌存活有关。

细胞凋亡水平检测：过表达PE_PGRS62的耻垢分枝杆菌抑制巨噬细胞凋亡。

内质网应激反应检测:过表达PE_PGRS62的耻垢分枝杆菌能够有效抑制巨噬细胞内质网应激反应。该实验结果表明，PE_PGRS62可能作为结核分枝杆菌的毒力因子，通过干扰细胞因子表达量和阻断ERS相关细胞凋亡，促进其在宿主巨噬细胞中持续存在的能力。

根据以上的三篇文献分析，我们发现，针对毒力基因的研究大体思路为：

  1. 目标基因选择（根据生物信息学分析基因功能或者临床株表型变化选定基因）；
  2. 对标准菌株进行遗传操作（基因敲除、过表达、点突变等），获得突变菌株；
  3. 结核分枝杆菌突变菌株体内外毒性分析（动物、细胞实验等），同时也可通过表型变化分析、组学分析等进一步确定基因功能。

对毒力基因的研究套路可概括为：


~欢迎讨论交流~

参考文献：

  1. Louis S.Ates, Anzaan Dippenaar, Roy Ummels, et al., Mutations in ppe38 block PE_PGRS secretion and increase virulence of Mycobacterium tuberculosis. Nature Microbiology, 2018 Feb;3(2):181-188.
  2. Tufariello JM, Chapman JR, Kerantzas CA, et al., Separable roles for Mycobacterium tuberculosis ESX-3 effectors in iron acquisition and virulence. Proc Natl Acad Sci U S A, 2016 Jan 19;113(3):E348-57.
  3. Quanxin Long, Xiaohong Xiang, Qingqin Yin, et al., PE_PGRS62 promotes the survival of Mycobacterium smegmatis within macrophages via disrupting ER stress‐mediated apoptosis. J Cell Physiol, 2019 Nov;234(11):19774-19784.

 

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