结核分枝杆菌能抑制巨噬细胞凋亡,这有助于结核分枝杆菌在细胞中的存活,然而抑制细胞凋亡的分子机制研究的还不是很透彻。在最近的Frontiers in Immunology期刊上发表的“Rv3033, as an Emerging Anti-apoptosis Factor, Facilitates Mycobacteria Survival via Inhibiting Macrophage Intrinsic Apoptosis”文章首次揭示Rv3033能够抑制巨噬细胞凋亡,论文作者通过一系列实验证明Rv3033能够抑制线粒体细胞色素C的释放、抑制内质网应激PERK通路激活并抑制caspase-9介导的内源性凋亡途径来抑制细胞凋亡。


研究背景

巨噬细胞是宿主杀伤结核分枝杆菌的第一道防线,然而结核分枝杆菌在与巨噬细胞的长期斗争中进化出了许多有助于其在巨噬细胞中存活的武器,抑制巨噬细胞凋亡就是其中的一种。结核分枝杆菌毒力因子SodA、NuoG、Eis、Rv3364c能抑制TNF-α或线粒体相关的细胞凋亡途径,是结核病预防或治疗的潜在靶点,寻找类似这些毒力因子的新型蛋白是研究热点。

2005年Rengarajan及其同事筛选了结核分枝杆菌转座子突变文库,挑选出了影响结核分枝杆菌在巨噬细胞中存活的一些必需蛋白。基于Rengarajan等人的研究,张等人筛选了其中的Rv0928、Rv1096、Rv3033、Rv3369,研究这四种蛋白是否影响巨噬细胞凋亡。

 

实验方案

 

实验结果

[1] BCG、H37Rv菌株对巨噬细胞致死率及在巨噬细胞中的存活能力不同

BCG、H37Rv菌株感染RAW264.7细胞24h,后用CCK8、TUNEL、Western blot方法对RAW264.7细胞凋亡进行分析。结果表明与BCG菌株相比,H37Rv菌株能抑制细胞凋亡、抑制细胞基因组DNA断裂、抑制cleaved-caspase 3的产生;H37Rv菌株感染的RAW264.7细胞中的菌的数量比BCG菌株感染的RAW264.7细胞中的多,这与H37Rv菌株抑制RAW264.7细胞凋亡结果一致。ZVAD能抑制细胞凋亡,预处理RAW264.7细胞后再用BCG菌株感染,与单独用BCG菌株感染相比,ZVAD处理组的RAW264.7细胞中的菌数明显偏高。

Fig1. BCG、H37Rv菌株对巨噬细胞致死率及在巨噬细胞中的存活能力不同

[2] Rv3033抑制结核分枝杆菌感染引起的巨噬细胞凋亡

为了研究Rv0928、Rv1096、Rv3033、Rv3369分别对巨噬细胞凋亡的影响,研究人员构建了这四种蛋白的耻垢分枝杆菌过表达菌株(Ms:: Rv0928、Ms:: Rv1096、Ms:: Rv3033、Ms:: Rv3369),感染巨噬细胞后进行凋亡检测,结果表明Rv3033能抑制细胞凋亡;Rv3033在结核分枝杆菌感染细胞的早期、晚期都有抑制细胞凋亡的作用。Western blot对Rv3033在BCG、H37Ra、H37Rv菌株中的表达检测表明,H37Rv菌株中的Rv3033表达量更高,进一步说明Rv3033抑制细胞凋亡的功能。

Fig2. Rv3033抑制结核分枝杆菌感染引起的巨噬细胞凋亡

[3] Rv3033降低结核分枝杆菌引起的巨噬细胞凋亡并促进结核分枝杆菌存活

为了进一步验证Rv3033抑制细胞凋亡的功能,研究人员构建了Rv3033 Raw264.7过表达细胞株RAW-Rv3033。BCG、H37Ra菌株感染RAW-Rv3033后进行Annexin V /7-AAD染色分析,结果表明,与对照组相比,RAW-Rv3033组细胞死亡数目更少;Rv3033在结核分枝杆菌感染巨噬细胞的早期、晚期都有抑制细胞凋亡功能,但是早期更为明显。H37Rv、H37Ra菌株感染RAW264.7、RAW-Rv3033细胞,后检测细胞Cleaved-caspase3的含量,发现Rv3033能抑制Cleaved-caspase-3的生成,高通量测序结果进一步验证了Rv3033这种抑制细胞凋亡功能。BCG、H37Rv菌株感染RAW264.7、RAW-Rv3033细胞,后对细胞中的菌数进行测定,发现Rv3033过表达后的细胞中BCG含量升高,这与Rv3033抑制细胞凋亡功能结果吻合。

Fig3. Rv3033降低结核分枝杆菌引起的巨噬细胞凋亡并促进结核分枝杆菌存活

[4] Rv3033通过抑制内源性凋亡途径抑制细胞凋亡

细胞凋亡通路主要包括caspase-9介导的内源凋亡途径及caspese-8介导的外源凋亡途径,这两条凋亡途径最终都会引起caspase-3的激活及细胞凋亡。研究人员用BCG菌株感染RAW264.7、RAW-Rv3033不同的时间,后Western blot检测Cleaved-caspase-3,发现Rv3033能显著降低Cleaved-caspase-3的生成;对细胞凋亡上游相关的Cleaved-caspase-8、Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-12 进行Western blot检测,结果表明Rv3033能显著抑制Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-12的生成而对Cleaved-caspase-8无影响。实验表明Rv3033通过抑制内源性凋亡途径而不是外源性凋亡途径来抑制细胞凋亡。

Fig4. Rv3033通过抑制内源性凋亡途径抑制细胞凋亡

[5] Rv3033阻断线粒体及内质网应激PERK通路介导的内源性细胞凋亡

为了确认结核分枝杆菌感染巨噬细胞后Rv3033是否影响线粒体介导的细胞凋亡,研究人员对线粒体、细胞质中的Bax、cytochrome c这两种细胞凋亡相关蛋白进行了Western blot检测,结果表明Rv3033能阻止Bax进入线粒体并阻止cytochrome c从线粒体中释放。表明Rv3033能抑制线粒体介导的内源性细胞凋亡。

为了确认结核分枝杆菌感染巨噬细胞后Rv3033是否影响内质网应激引起的细胞凋亡,研究人员用牛磺酸去氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)预处理RAW264.7、RAW-Rv3033后用BCG菌株感染细胞,设置多组对照组,BCG菌株感染细胞36h后检测细胞凋亡情况,结果表明牛磺酸去氧胆酸能抑制结核分枝杆菌引起的细胞凋亡,说明内质网应激参与结核分枝杆菌引起的凋亡发生。进一步用salubrinal特异性抑制内质网应激凋亡通路中的PERK蛋白,后用BCG菌株感染RAW264.7细胞,细胞凋亡检测结果表明salubrinal抑制BCG菌株感染导致的细胞凋亡,说明PERK参与了凋亡发生过程。BCG菌株或内质网应激激活剂衣霉素(tunicamycin,Tm)处理RAW264.7、RAW-Rv3033细胞后,对PERK凋亡通路中的下游蛋白p-eIF2α、CHOP、BIP进行Western blot检测,结果表明Rv3033能抑制这些蛋白的表达。表明Rv3033能抑制内质网应激介导的内源性细胞凋亡。

Fig5. Rv3033阻断线粒体及内质网应激PERK通路介导的内源性细胞凋亡

 

实验结论

一系列实验证明Rv3033能够抑制线粒体细胞色素C的释放、抑制内质网应激PERK-eIF2a-Chop-通路激活并抑制caspase-9介导的内源性凋亡途径来抑制细胞凋亡。

总结图:结核分枝杆菌Rv3033抑制巨噬细胞凋亡机制模式图

 

思路延伸

1. Rv3033在巨噬细胞中的相互作用蛋白为哪种蛋白?

2. 结核分枝杆菌分泌Rv3033机制为何?在感染巨噬细胞中的哪个时期分泌?哪些调控因素调节Rv3033的分泌?

3. Rv3033如何阻止线粒体细胞色素C释放及内质网应激信号通路激活?

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