结核分枝杆菌是一种进化非常成功的病原菌,这很大程度上归功于其能够对抗宿主细胞杀伤及免疫作用。

结核分枝杆菌Rv0177基因位于Mce1基因操纵子区,与Rv0175、Rv0176一起被转录,编码一种保守蛋白,结核分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞后其表达量升高,能够保证结核分枝杆菌在小鼠巨噬细胞中存活。

为了深入了解Rv0177蛋白的功能,谢等人在耻垢分枝杆菌中进行了Rv0177的异源表达,构建了MS_Rv0177菌株,表达的Rv0177位于其细胞壁。与野生型菌株相比,MS_Rv0177菌株生物膜滑动、细胞壁结构、通透性都发生改变。MS_Rv0177菌株感染RAW264.7细胞后,RAW264.7细胞的MCP-1、MCPIP(MCP-1 inducible protein)、CHOP(C/EBP homologous protein)表达量升高而IL-6表达量降低。MS_Rv0177菌株感染RAW264.7细胞会激活细胞JNK信号通路,激活Caspase-3并促发细胞凋亡。

谢等人揭示了Rv0177蛋白相关功能,研究成果 “Mce-associated protein Rv0177 alters the cell wall structure of Mycobacterium smegmatis and promotes macrophage apoptosis via regulating the cytokines”发表于最近的International Immunopharmacology杂志。

研究背景

结核病是严重威胁公共健康的疾病,每年可导致百万人死亡及将近900万人的感染新发病例。许多结核分枝杆菌毒力相关蛋白目前已被确认,几种Mce蛋白经研究证明参与结核分枝杆菌致病,是其毒力因子,但是很多mce基因家族成员功能还不明确。

结核分枝杆菌H37Rv基因组有mce1-4四种类型的操纵子,每种类型的操纵子包括2种yrbE基因(yrbEAyrbEB)和6种mce基因(mceAmceBmceCmceDmceEmceF)。

mce1-4操纵子编码的ABC样转运蛋白对结核分枝杆菌脂类代谢平衡非常重要。mce4编码一种胆固醇转入蛋白,对结核分枝杆菌在IFN-γ活化的巨噬细胞及动物肺部中存活必不可少。

在BALB/C小鼠中,重组LprN能够促进TNF-α、IFN-γ的释放并引起Th1型免疫反应。在小鼠巨噬细胞RAW264.7中,Mce3E能够通过降低ERK1/2的磷酸化及蛋白翻译而抑制TNF-α、IL-6的表达。

牛结核分枝杆菌mce2phoP双基因敲除菌株是治疗牛结核病的候选疫苗之一。mce1操纵子中的13个基因(Rv0166Rv0178)同时转录,受Mce1R (Rv0165)负调控。脂酰辅酶A合成酶Fad5对分枝菌酸的代谢至关重要。包被有Mce1A(Rv1067)重组蛋白的聚苯乙烯乳胶微球很容易被HeLa细胞吸收。mce1操纵子功能缺失会导致alpha、methoxy 、keto等类型的游离型分枝菌酸在细胞壁聚集。mce突变型高毒力菌株会通过TLR2信号通路抑制细胞TNF-α、IL-6、NO的释放。Rv0177是54种可能参与结核分枝杆菌-宿主细胞相互作用蛋白中的一种,功能有待深入研究

 

实验方案

实验结果

[1]结核分枝杆菌Rv0177基因能够在耻垢分枝杆菌中异源表达

结核分枝杆菌Rv0177mce1操纵子的成员之一,在牛结核分枝杆菌、海分枝杆菌及非致病的耻垢分枝杆菌中有其同源基因,是一种保守基因。Rv0177编码蛋白产物约20kDa。研究人员以pNIT_Myc为载体,构建了pNIT_Rv0177_Myc重组质粒;将pNIT_Myc、pNIT_Rv0177_Myc质粒分别电转到耻垢分枝杆菌M. smegmatis mc2 155中, Rv0177基因PCR实验证明电转成功,Western blot实验证明Rv0177_Myc融合蛋白成功表达,成功构建了MS_Vec、MS_Rv0177两种重组菌株。


Fig.1 Rv0177在MS_Rv0177菌株中过表达

[2]Rv0177蛋白定位于MS_Rv0177菌株细胞壁

生物信息学分析表明Rv0177蛋白具有跨膜结构域。为了确定Rv0177蛋白的亚细胞定位,研究人员对MS_Vec、MS_Rv0177菌株进行蛋白诱导表达,后收集菌液,超声破碎后进行Western blot实验验证,结果表明Rv0177蛋白定位于细胞壁,而对照蛋白GroEL2位于细胞质中。


Fig.2 Rv0177蛋白定位于MS_Rv0177菌株细胞壁

[3]MS_Rv0177菌株滑动能力改变

结核分枝杆菌生物膜具有保护细菌免受宿主免疫及药物攻击,保护其在宿主体内持续存在与复制,其形成离不开结核分枝杆菌的滑动能力。研究人员将MS_Rv0177菌株涂布在固体培养基上培养,发现其滑动能力增强;结核分枝杆菌细胞壁糖脂(GPLs,glycopeptidolipids)及分枝菌酸被认为与结核分枝杆菌滑动能力密切相关,然而GC-MS、TLC实验表明MS_Rv0177菌株中的GPLs、分枝菌酸未发生明显变化,与之前的研究结果不同。


Fig.3 MS_Rv0177菌株滑动能力分析

 

[4]Rv0177蛋白改变耻垢分枝杆菌细胞壁结构并降低其通透性

为了进一步探究MS_Rv0177菌株细胞壁的改变,研究人员进行了透射电镜观察,结果表明MS_Vec菌株细胞壁表面比较模糊,而MS_Rv0177菌株细胞壁表面更加致密,这与滑动能力检测结果相一致。

 

EB是一种可扩散的小分子荧光染料,能够自由的穿过细菌细胞壁及细胞膜。研究人员用EB来检测Rv0177对耻垢分枝杆菌细胞壁通透性的改变,结果表明用EB分别处理MS_Vec、MS_Rv0177菌株1h后,MS_Rv0177菌株中积累的EB明显低于MS_Vec菌株,进一步证实了Rv0177蛋白改变了耻垢分枝杆菌细胞壁。


Fig.4 Rv0177对耻垢分枝杆菌细胞壁结构及通透性影响

[5]Rv0177降低了耻垢分枝杆菌在RAW264.7细胞中的存活能力

包被有Mce1A(Rv1067)重组蛋白的聚苯乙烯乳胶微球很容易被没有吞噬作用的HeLa细胞吸收,M. tuberculosis Δmce1菌株在C57BL/6小鼠的肝脏、脾脏、肺中有很高的载菌量。然而,MS_Vec、MS_Rv0177菌株处理RAW264.7细胞4h,结果表明两种菌株在RAW264.7细胞中的载菌量基本相同;两种菌株分别处理RAW264.7细胞24后,结果表明RAW264.7细胞中MS_Rv0177菌含量低于MS_Vec;两种菌株的体外生长情况也基本相同。研究人员认为Rv0177降低了耻垢分枝杆菌在巨噬细胞中的存活。


Fig.5 Rv0177对耻垢分枝杆菌在巨噬细胞中的存活影响

[6]Rv0177改变巨噬细胞细胞因子表达

为了研究Rv0177的毒力作用,研究人员用MS_Vec、MS_Rv0177菌株分别处理RAW264.7细胞不同时间,后采用RT-PCR、ELISA实验分别对RAW264.7细胞细胞因子的转录、表达情况进行分析,结果表明MS_Rv0177菌株处理RAW264.7细胞后TNF-α、IL-1β转录及表达与MS_Vec实验组无明显差别,但IL6转录、表达下降,MCP-1转录、表达升高。MS_Vec、MS_Rv0177菌株分别处理PMA诱导分化的THP-1细胞,细胞因子转录、表达与RAW264.7实验组一致。结果表明Rv0177能打破细胞因子平衡,对结核分枝杆菌感染宿主细胞后的命运至关重要。


Fig.6 Rv0177对巨噬细胞细胞因子转录、表达影响

[7]Rv0177影响巨噬细胞存活能力

为了研究MS_Rv0177菌株对巨噬细胞的毒性,研究人员用MS_Vec 、MS_Rv0177菌株处理RAW264.7细胞6h、24h、48h,后用MTT法检测细胞存活数目,结果表明MS_Rv0177菌株处理组570nm处甲臜吸收值低于MS_Vec组;与MTT结果一致的是,MS_Rv0177菌株处理组RAW264.7细胞释放的LDH高于MS_Vec组,表明Rv0177对巨噬细胞具有毒性。


Fig.7 Rv0177对RAW264.7细胞具有毒性

[8]Rv0177促进巨噬细胞凋亡

细胞因子平衡被打破后能导致细胞死亡,为了进一步研究Rv0177对巨噬细胞凋亡的影响,研究人员采用了Annexin V/PI双染色法对早期、晚期凋亡巨噬细胞进行检测(Annexin V-FITC标记早期凋亡细胞,显示绿光;PI标记坏死细胞,显示红光;晚期凋亡细胞能被Annexin V/PI双标记,红、绿光都有)。MS_Vec、MS_Rv0177菌株感染RAW264.7细胞6h、48h后Annexin V/PI染色结果表明,MS_Rv0177菌株组Annexin V-FITC荧光斑点数目是MS_Vec菌株组的1.44倍左右,Annexin V/PI荧光斑点数目是MS_Vec菌株组的1.58倍左右。Western blot实验也证实MS_Rv0177菌株组活化的Caspase3含量更高。这些数据表明Rv0177能够促进巨噬细胞凋亡。


Fig.8 Rv0177促进RAW264.7细胞凋亡

[9]MCPIP及内质网应激可能参与MS_Rv0177-巨噬细胞相互作用

结核分枝杆菌感染宿主后,MCP-1蛋白参与肉芽肿的形成及维持,并与结核病严重程度相关。MCP-1与CCL2受体结合,诱导MCPIP的表达。MCPIP具有CCCH型锌指结构域,具有RNase功能,能够剪切IL6、IL12及MCPIP自身的mRNA;表达水平升高的MCPIP能控制宿主细胞中结核分枝杆菌的存活并导致内质网应激。CHOP是内质网应激伴侣蛋白,在内质网应激介导的细胞凋亡途径中起着重要作用;GRP78促进错误折叠蛋白的降解,缓解内质网应激。为了研究Rv0177是否能促进MCPIP的表达并诱发内质网应激,研究人员用MS_Vec、MS_Rv0177菌株分别感染RAW264.7细胞,检测MCPIPCHOPGRP78转录情况,结果表明MCPIPCHOP转录水平升高,GRP78转录水平降低,Rv0177可通过调控MCPIP及内质网应激发挥其功能。


Fig.9 Rv0177促进MCPIP表达并诱发内质网应激

[10]Rv0177对RAW264.7细胞JNK信号通路影响

JNK、p38、ERK1/2等是MAPK信号通路中的蛋白,参与MCP-1的表达调控,能被结核分枝杆菌抗原诱导而磷酸化;NF-κB转录调控因子参与调控许多免疫相关基因。为了研究这些蛋白是否受Rv0177影响,研究人员在用MS_Vec、MS_Rv0177菌株感染RAW264.7细胞前先用每种蛋白特定的抑制剂对蛋白进行抑制(NF-κB抑制剂TPCK,JNK抑制剂SP 600125,p38抑制剂SB 202190),抑制1h后,用MS_Vec、MS_Rv0177菌株感染RAW264.7细胞,后检测MCP-1、MCPIP、CHOP等基因的转录情况。结果表明,NF-κB抑制剂TPCK处理后,MS_Vec菌株组MCP-1转录显著下降,而对MS_Rv0177菌株组无明显影响; MS_Rv0177菌株实验组,JNK抑制剂SP 600125预处理与DMSO预处理相比,MCP-1、MCPIP、CHOP转录显著下降,说明Rv0177能激活JNK信号通路,诱导MCP-1、MCPIP表达并诱发内质网应激反应。

实验结论

研究人员首先构建了MS_Rv0177重组表达菌株,体外实验结果表明Rv0177过表达增强了耻垢分枝杆菌滑动、促使细胞壁致密并降低了细胞壁通透性;MS_Rv0177菌株感染RAW264.7细胞实验表明,Rv0177降低RAW264.7细胞IL-6表达,促进MCP-1、MCPIP(MCP-1 inducible protein)、CHOP(C/EBP homologous protein)转录,激活细胞JNK信号通路及内质网应激,活化Caspase-3,促进巨噬细胞凋亡,是结核分枝杆菌的毒力因子。


总结图:Rv0177功能模式图

思路延伸

  • Rv0177在巨噬细胞中是否有互作蛋白:可以用人蛋白芯片筛?
  • Rv0177定位于耻垢分枝杆菌细胞壁,使其细胞壁致密,对耻垢分枝杆菌蛋白分泌、营养吸收等有何影响?
  • Rv0177使耻垢分枝杆菌毒性增强,是Rv0177直接发挥作用,还是通过改变耻垢分枝杆菌脂类、蛋白等间接影响?
  • MS_Rv0177菌株感染巨噬细胞所需受体与野生型耻垢分枝杆菌有何不同?
  • MS_Rv0177菌株是否影响巨噬细胞自噬?
  • JNK、p38、NF-κB等如何调控MCP-1、MCPIP、CHOP转录,多种抑制剂共同处理后,结果是否与单一抑制剂处理一致?

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