近年来，文库制备方法、测序和计算生物信息学的技术进步，使我们能以更低的成本实现更快速和更全面的宏基因组分析。近年来，二代测序在临床上的应用也越来越广泛，将二代测序应用于病原体检测、预测对结核一线药物敏感性，可提高临床诊断的效率，有助于药物的选择。
mNGS应用于临床检测病原体
病原体宏观基因组二代测序（mNGS）技术结合临床病原菌诊断，单次实验同时检测多种病原体，全面覆盖细菌、真菌、病毒及寄生虫等近7000种病原微生物。目前，已有多家国内单位正在进行相关产品的研究开发与临床应用。
基因检测结果辅助临床确定患者感染病因，快速诊断病原体后促进了临床及时的针对性抗生素治疗，目标锁定病原菌并全力攻击，达到治疗目的。但目前mNGS的可及性还较为局限，主要适合急危重症和疑难感染的临床诊断。
二代测序技术的发展为感染性疾病诊断带来了革命性的进展，尤其针对于结核病的检测。2017年11月9日，国家卫生和计划生育委员会发布了《肺结核诊断标准》和《结核病分类标准》，修订内容中结核病病原实验室检查除常规分枝杆菌涂片检查外，新增分枝杆菌分离培养和分子生物学检查等内容；肺结核和肺外结核如结核性脑膜炎的病原学检查也涵盖了结核分枝杆菌核酸检测内容。由此可见，分子生物学检测手段如PCR，原位杂交和基因测序等已逐渐发展为结核的辅助诊断的重要工具。
结核检测的常规方法采用涂片或者结核杆菌培养的方式确定结核阳性，但结核杆菌培养时间较长，而二代检测能较快检测多类标本中结核杆菌复合群，可用于活动性结核病的早期辅助诊断。医生在短时间内就能知道病人是哪种病原微生物感染，而且能测定病原体是否产生耐药性、对哪种抗生素产生耐药性、对哪种抗生素敏感等等，这样医生就能有的放矢地制定科学的治疗方案。
source | Vectorarte
案例
43岁女性患者，因发热、呼吸困难入院，经检查临床针对性抗炎抗感染治疗，然而出院后因发热再次入院，经痰涂片检测考虑为肺结核，后转入XX市红十字会医院结核ICU科室，进行了进一步检查，对骨髓标本进行感染病原高通量基因检测，测序结果回报检出结核分枝杆菌复合群序列数1116条，人类疱疹病毒4型（EB病毒）3条。经多方验证协助临床明确患者结核杆菌感染。
检出病毒列表
检出结核分枝杆菌复合群列表
注：mNGS检出高序列的结核分枝杆菌复合群，与临床检测结果一致，可确诊为结核感染；
如检测出低序列的结核分枝杆菌复合群，需要临床根据患者情况及其他辅助检查做出综合诊断。
mNGS技术用于检测结核病优势：没有偏移性，广覆盖，高效率。mNGS技术采用了一网打尽的策略。
当然，缺陷也是存在的，主要问题是mNGS提取核酸效率低导致敏感性不高，会存在假阴性可能，从而影响检测结果，临床诊断还需结合多种检测进行结果分析。
背景微生物的污染是mNGS技术面临的常见问题，可以通过阴性质控进行部分排除，但需要临床熟悉常见背景菌同时结合临床实践更好的解读结果。
NGS应用于预测结核一线药物敏感性
NGS技术不但可以诊断传染病病原体，还可以预测结核分枝杆菌对结核一线药物（异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺）的敏感性。Xpert MTB检测法是鉴定结核分枝杆菌复合群和rpoB基因突变（可预测多药耐药性）的WHO推荐使用的分子检测方法，但由于该检测仅针对少数潜在的致耐药突变，因此无法从阴性结果中可靠地推断出对抗菌药物的敏感性。
研究结果显示，相对于WHO推荐的基于PCR的检测方法可以预期的灵敏度，测序分析的性能显著较好，因为全基因组测序能够识别较多的突变。然而，多识别出的这些突变同时会导致特异度降低，有少数分离株未表现出耐药表型。典型的例子是rpoB I491F突变，该突变经常与在液体培养物中表明对利福平敏感的结果相关，但还与治疗失败有关。
全基因组测序目前可用于确定对一线抗结核药物的敏感谱，准确度足以供临床使用。基因组方法可以采用表型分型类似的方式，用于指导医师在开处方时选择哪些药物，而不仅仅是避免使用哪些药物。其次，数据支持在常规进行全基因组测序的地方，制订计划减少与结核分枝杆菌培养和敏感性分析相关的工作量。基因型预测是基于异烟肼（ahpC、inhA、fabG1和katG）、利福平（rpoB）、乙胺丁醇（embA、embB和embC）和吡嗪酰胺（pncA）耐药性相关基因内或上游的突变。如果所有致耐药突变都是已知的，则可以根据没有这些突变推断出结核分枝杆菌对抗菌药敏感，因为全基因组测序涵盖的基因组位点数量几乎不受限制，可能无法检测到具有复杂基础基因相互作用的耐药机制。
对于预测扩展至二线和三线药物以及新化合物，我们还有许多工作要做。
结语
在一个不断出现病原体的世界中，宏基因组测序的检测将在监测和跟踪新的疾病爆发中发挥关键作用。作为一种全面的直接检测方法，宏基因组测序可能最终取代临床微生物学中的培养、抗原检测和聚合酶连锁反应方法，但病毒血清学检测等间接方法将继续在感染诊断检测中发挥关键作用。在不久的将来，宏基因组测序不会是奢侈品，而是临床医生的医疗装备中的必需品，因为我们与传染病的斗争是永无止境的！
参考文献：
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- Prediction of Susceptibility to First-Line Tuberculosis Drugs by DNA Sequencing.The NEW ENGLAND JOURNAL of MEDICINE.2018; 379:1403-1415.
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