目前,耐药结核菌的传播与蔓延已成为结核病控制的难题。结核耐药机制有3种观点:
(1)细胞壁结构与组分变化,使细胞壁通透性改变,药物通透性降低,产生降解或灭活酶类,改变了药物作用靶位。
(2)可能存在耐药质粒或转座子介导的耐药;在MTB中已经发现了活跃的药物外排泵系统,外排泵能将菌体内药物泵出,使胞内药物浓度不能有效抑制或杀死分枝杆菌,从而产生耐药性。
(3)结核耐药性的产生多见于其基因组上编码药物标靶的基因或药物活性相关的酶基因突变所造成。目前对结核杆菌耐药分子机制的研究主要集中在各种药物的作用靶点及相关基因的突变上。常见抗结核药物耐药基因及对应突变位点见下表:
今天小编就和各位老师一起学习几篇关于结核耐药机制研究的文章,总结一下典型的耐药机制研究思路。
文献1:cycA点突变导致BCG对环丝氨酸耐药
一、研究思路

1. 目的基因选择:cycA
2. 重组菌株构建:BCG-Pasteur::I425、BCG-Pasteur::pYUB412(对照)、M.smegmatis mc2155::pYUB412、M.smegmatis mc2155::I425、M.smegmatis mc2155/pMDcycAMtbM.smegmatis mc2 155/pMDcycAMbovM. smegmatis mc2155/pMDcycABCG
3. 耐药机制研究:通过对以上重组菌株进行环丝氨酸(DCS)药敏实验,检测在不同环丝氨酸浓度培养条件下,各重组菌株生长情况。

二、实验内容与结果

根据报道推测,BCG的cycA基因点突变(G122S)导致该基因功能损害,从而导致BCG对DCS耐药性提高。
 
在BCG和耻垢分枝杆菌中表达结核分枝杆菌cycA基因,构建结核分枝杆菌cycA(Rv1704c)基因表达菌株,载体为pYUB412(整合型),电转至M.bovisBCG-Pasteur 1173P2和M.smegmatis mc2155,获得重组菌株BCG-Pasteur::I425和M.smegmatis mc2155::I425,将质粒pYUB412电转至M.bovisBCG-Pasteur 1173P2和M.smegmatis mc2155作为对照,获得菌株BCG-Pasteur::pYUB412(图1-1A)以及M.smegmatis mc2155::pYUB412。
DCS药物敏感性分析结果表明,与对照相比,DCS浓度为8、16 μg/mL时,BCG-Pasteur::I425的生长明显受到抑制(图1-1B)。在DCS浓度为32 μg/mL培养,与对照相比,BCG-Pasteur::I425的生长明显受到抑制(图1-1C),M.smegmatismc2155::I425环丝氨酸敏感性无明显差异(图1-1D、E)。
 
结果表明,BCG对DCS具有耐药性,在BCG中表达结核分枝杆菌的cycA基因,敏感性恢复。

图1-1 BCG、耻垢分枝杆菌中表达cycA基因菌株耐药分析

注:图B中白色为BCG-Pasteur::I425,黑色为BCG-Pasteur::pYUB412。图C方形为BCG-Pasteur::I425,菱形为BCG-Pasteur::pYUB412。图D中白色为M. smegmatis mc2155::I425,黑色为M. smegmatismc2155::pYUB412。图E中方形为M. smegmatis mc2155::I425,菱形为M.smegmatismc2155::pYUB412。

在耻垢分枝杆菌中分别过表达M.tbM.boiv、BCG的cycA基因,载体为pMD31(多拷贝),其中BCG的cycA基因为缺陷型,M.tbM.boiv的cycA基因为功能型。对重组菌株药敏性分析结果显示,过表达M.tbM.boivcycA基因菌株药物敏感性提高,而过表达BCG的cycA基因菌株的药物敏感性与对照一致,未见菌株对环丝氨酸药物敏感性明显提高(图1-2A)。DCS浓度为200 μg/mL情况下,与对照相比,M.smegmatismc2155/pMDcycAMtbM.smegmatis mc2155/pMDcycAMboiv菌株生长明显受到抑制(图1-2B)。

 
结果表明,cycA基因表达量提高,对DCS敏感性提高,且BCG的cycA基因突变导致其编码产物失去活性。

图1-2耻垢过表达菌株对DCS敏感性实验

注:黑色为M. smegmatis mc2155/pMD31(对照),白色为M. smegmatis mc2155/pMDcycAMtb,浅灰为M. smegmatis mc2155/pMDcycAMbov,深灰为M. smegmatis mc2155/pMDcycABCG

 

文献2:全基因组测序与耐药机制研究

一、研究思路

1. 目的基因选择:ald(Rv2780)
2. 重组菌株构建:ald基因敲除菌株∆ald、回补菌株∆ald-comp、BCG-∆ald-comp。
3. 耐药机制研究:为确定新的耐药基因型,首先对498株药敏菌株进行全基因组测序及表型耐药分析,结合进化分析,筛选相关基因,构建重组菌株后进行药敏实验,分析各菌株耐药性。

二、实验内容与结果

将498株来自中国和南非的结核分枝杆菌,通过表型耐药分析与测序结果进行比对,结果如表格2-1所示,表型耐药与基因突变机制耐药不对应的数量较少,推测基于个体突变的新耐药机制可能比较少见。

表2-1 菌株耐药性分析

新耐药基因型分析,去除已知耐药基因型,在25株南非菌株中鉴定了11种不同的ald(Rv2780)基因功能缺失突变(图2-1),该基因的功能缺失可能与耐药性相关。

图2-1 结核分枝杆菌ald基因功能缺失突变的趋化进化

ald基因编码L-丙氨酸脱氢酶,是丙氨酸代谢途径的组成部分,其中包括二线药物环丝氨酸的靶标。为了确定是否因为ald基因功能丧失导致对环丝氨酸产生耐药性,构建ald基因敲除菌株∆ald(CDC1551环丝氨酸敏感菌株),回补菌株∆ald-comp,BCG对环丝氨酸耐药,且ald基因功能缺失,构建ald在BCG中的回补菌株BCG-∆ald-comp。
通过对以上菌株进行耐药性分析,发现ald基因功能缺失的M.tb对环丝氨酸耐药性提高,然而BCG的ald基因回补菌株与BCG相比,耐药性没有明显变化(表2-2)。
对以上菌株在不同浓度环丝氨酸环境下培养,检测菌株生长情况,结果表明,7.5 μg/mL的环丝氨酸浓度下,相较于野生型菌株,∆ald菌株有显著的生长优势,将浓度提高至15 μg/mL,∆ald菌株依旧有显著的生长优势,但生长慢于BCG(图2-2)。
 
根据药敏分析,证实ald基因功能缺失导致菌株耐药,但耐药性低于BCG。

表2-2 ald功能缺失药敏性分析

图2-2 重组菌株生长情况

文献3:Sig B调控PABA合成途径从而导致PAS敏感性变化(非突变)

一、研究思路:

1. 目的基因选择:sigma B
2. 重组菌株构建:构建sigma B基因敲除菌株H37Ra ∆sigB、回补菌株H37Ra ∆sigB pMV261::sigBpabB过表达菌株H37RapMV261::pabBpabC基因敲除菌株H37Ra ∆pabC
3. 耐药机制研究:药敏性分析检测突变株对抗结核药物敏感性;转录组学分析、qRT-PCR、WB检测敲除突变株与野生菌株之间各基因表达水平差异。

二、研究内容与结果

sigB调控pabB基因表达,从而影响PABA的合成,PABA的合成中断的会导致菌株对叶酸类药物PAS药物敏感性提高。构建敲除菌株H37Ra ∆sigB和回补菌株H37Ra ∆sigB pMV261::sigB,检测野生型菌株和重组菌株对各种抗结核药物的MIC。
 
菌株H37Ra ∆sigB对抗结核药物敏感性增加(表3-1),过表达pabB基因菌株对PAS的MIC提高,对PAS产生了耐药性(表3-2)。

表3-1 检测H37Ra ∆sigB、H37Ra ∆sigB pMV261::sigB、H37Ra各种结核药物MIC

表3-2 检测不同菌株对PAS的MIC

液体培养WT、敲除菌株、回补菌株,加入0.4mg/mL的PAS,培养至第四天,H37Ra ∆sigB下降至5*103,而野生及回补的CFU为5*105,H37Ra ∆sigB培养至8天急剧减少(图3-1)。

图3-1 PAS对sigB基因缺失结核菌株的影响

 

转录组学分析,敲除突变株与野生型菌株各基因表达水平差异,其中175个基因标注为显著调控,33个上调,142个下调。其中与PABA合成相关基因pabB基因下调(表3-3)。

表3-3 转录组学分析各基因转录水平差异

分别采用RT-PCR分析敲除突变株与野生菌株pabB基因转录水平差异,采用WB检测敲除突变株与野生菌株pabB表达水平差异,结果表明,与转录组学分析结果一致,敲除突变株pabB基因转录水平明显低于野生型菌株(图3-2A),敲除突变株pabB表达水平也明显低于野生型菌株(图3-2B)。
 
以上结果表明,sigB基因可通过调控pabB基因表达,从而影响PABA合成途径,导致菌株对PAS药敏性发生变化。

图3-2 敲除sigApabB的影响

 

根据以上的三篇文献分析,我们发现,针对耐药机制的研究大体思路为:

(1)根据文献报道或全基因组测序分析选择目的基因(突变导致耐药或研究调控靶标基因表达导致耐药);

(2)对目标菌株进行遗传操作(基因敲除、回补、过表达、点突变),获得重组菌株;

(3)对以上重组菌株药物敏感性分析,分析耐药机制。

 

对耐药机制的研究思路可概括为:

 

参考文献:

  1. Chen JM, Uplekar S, Gordon SV, Cole ST.A Point Mutation in cycA Partially Contributes to the Dcycloserine Resistance Trait of Mycobacterium bovis BCG Vaccine Strains. PLoS One.2012;7(8):e43467.
  2. Desjardins CA, Cohen KA, Munsamy A, et al., Genomic and functional analyses ofMycobacterium tuberculosis strains implicate ald in d-cycloserineresistance. Nat Genet. 2016May;48(5):544-51.
  3. Yang SS, Hu YB, Wang XD, et al., Deletion of sigB Causes Increased Sensitivity to para-Aminosalicylic Acid and Sulfamethoxazole in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 2017 Sep 22;61(10). pii: e00551-17.
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