修饰蛋白质组学：将蛋白定量技术与蛋白质修饰富集技术相结合，在鉴定翻译后修饰位点的同时，对不同的样本中翻译后修饰的程度进行相对定量，实现大规模的修饰蛋白质组学定性和定量分析，从而进一步揭示某些生理、病理机制，寻找生物标志物、药物的作用靶点等。
蛋白质翻译后修饰类型多样，目前已有报道包括磷酸化、N-糖基化、乙酰化、泛素化、甲基化、丙酰化、丙二酰化、戊二酰化、琥珀酰化等。
文献解读：赖氨酸乙酰基化在M.tb中的功能
蛋白质的赖氨酸乙酰化是一种可逆的翻译后修饰，在真核生物和原核生物中起着重要的调控作用。赖氨酸乙酰化可能在结核分枝杆菌的发病机制中起重要作用，然而，目前已知的结核病乙酰化蛋白很少，这是理解可逆赖氨酸乙酰化在该病原体中的功能作用的主要障碍。该文研究主要内容如下：
（1）结核分枝杆菌H37Ra乙酰基化蛋白质组学分析。
（2）在赖氨酸乙酰化谱数据生物信息学分析基础上，为进一步验证乙酰化修饰在细胞生理过程中的功能，该研究通过构建MRA_1161基因（编码去乙酰化酶Sir2类蛋白，目前结核分枝杆菌中唯一已知去乙酰化酶）缺失突变株，验证蛋白质乙酰化对菌株形态、生物膜形成、热激反应、碳源利用的影响。
（3）乙酰化对热休克蛋白HspX的免疫原性影响。
结核分枝杆菌H37Ra乙酰基化蛋白质组学分析
（1）溶液和凝胶中消化蛋白提取物，并进行连续的胰蛋白酶处理。
（2）将提取的蛋白质消化后的肽段在反相C18柱上进行分离和脱盐，收集低丰度的修饰位点。
（3）利用抗乙酰赖氨酸抗体对赖氨酸乙酰化肽段进行免疫富集。
（4）用nanoLC-MS/MS在电喷雾离子阱质谱仪上进行鉴定。
（5）对原始数据进行处理，生物信息学分析。
1. 结核分枝杆菌H37Ra乙酰基化蛋白质组学分析
共检测到137个乙酰化蛋白，共226个乙酰化位点。其中in-gel检测72个乙酰化蛋白，in-solution检测115个乙酰化蛋白，其中有50个一致。in-gel检测105个乙酰化位点，in-solution检测187个乙酰化位点，其中有66个一致。
计算了结核分枝杆菌H37Ra蛋白组中每个蛋白修饰位点的数量，以评估乙酰化位点的分布，其中71.53%的蛋白只有一个乙酰化位点。高度乙酰化蛋白质有：GroEL、HspX。
为了进一步研究乙酰化蛋白的功能信息，根据GO注释对乙酰化蛋白的生物学过程和分子功能进行了分类。对生物学过程富集分析，发现蛋白质乙酰化与以下GO生物学过程密切相关：前体代谢物和能量的产生，乙酰辅酶A分解代谢过程，柠檬酸循环，乙酰辅酶A代谢过程，辅助因子分解代谢过程，辅酶降解过程，有氧呼吸，细胞呼吸等代谢过程。对鉴定的乙酰化蛋白进行KEGG代谢途径分析，结果表明，TCA循环、乙醛酸和二羧酸代谢、脂肪酸代谢等途径被显著富集，因此推测乙酰化修饰在TCA循环中发挥了重要作用。
2. 乙酰化赖氨酸位点分析
为了解乙酰化位点周围氨基酸的分布规律，检查了乙酰化位点两侧的12个残基（上下游各6个）出现频率，并绘制了热力型数据图。
根据热图分析发现，三个侧翼位点有很强的氨基酸偏爱性，谷氨酸在-1位置出现频率较高，苯丙氨酸在+1位置出现频率较高，赖氨酸在+3位置出现频率较高。结核分枝杆菌H37Ra蛋白乙酰化位点两侧氨基酸残基的差异表明，这种修饰是由一种新的乙酰转移酶亚群催化的，具有独特的底物偏好。乙酰化位点常发生在二级结构有序的区域，为了更详细地研究乙酰化位点周围蛋白序列的局部二级结构，比较了乙酰化赖氨酸的二级结构与所有赖氨酸。还评估了乙酰化赖氨酸位点的溶剂可及性;鉴定的乙酰化赖氨酸位点中有84.3%暴露于蛋白表面，而所有赖氨酸残基中有78.7%暴露于蛋白表面。这一结果表明，高度保守的乙酰化位点具有局部结构偏好，更倾向于出现在α-螺旋和蛋白质表面。
为评估结核分枝杆菌乙酰化蛋白的进化保守性，结核分枝杆菌的蛋白组与其他231个物种蛋白组进行比对，结果表明，与非乙酰化蛋白相比，结核分枝杆菌H37Ra的乙酰化蛋白具有更高的保守性。
3. 乙酰化蛋白功能相互作用网络
利用蛋白质相互作用数据库中的蛋白质相互作用信息，建立了蛋白质相互作用网络，以识别已鉴定的乙酰化蛋白质之间的物理和功能相互作用。结果表明，在结核分枝杆菌中，蛋白翻译可能受赖氨酸乙酰化的调控，而大多数已鉴定的乙酰化蛋白都参与控制关键代谢过程的中心代谢通路。已知的结核分枝杆菌免疫原HspX与其他功能相关蛋白紧密相互作用。
4. 代谢酶的乙酰化修饰
结核分枝杆菌H37Ra中许多乙酰化蛋白参与中心代谢途径，赖氨酸乙酰化酶参与糖酵解、糖异生和柠檬酸循环，在中心代谢途径乙酰化的酶中，有8种是柠檬酸循环的组成部分，以及2种参与了乙醛酸酯的代谢途径，异柠檬酸裂解酶(ICL1)和苹果酸合成酶(GlcB)，在结核分枝杆菌中，异柠檬酸裂解酶和苹果酸酶是该细菌在体内存活所必需的。
除了柠檬酸循环和乙醛酸途径中的酶外，在结核分枝杆菌中还发现了许多与脂肪酸代谢相关的酶被乙酰化，包括一些参与脂肪酸氧化的酶和一些参与脂肪酸生物合成的酶。在结核分枝杆菌中，脂肪酸及其代谢衍生物是细胞壁复合体的重要组成部分，与细菌的致病性有关。蛋白质组数据表明乙酰化在结核分枝杆菌的脂肪酸代谢中起着重要的作用。
结核分枝杆菌赖氨酸乙酰化蛋白生物功能研究
1. 构建去乙酰化酶编码基因敲除菌株H37Ra∆MRA_1161
MRA_1161基因敲除示意图
PCR验证敲除菌株、SDS-PAGE及免疫印迹
lane 1: M.tb H37Ra；lane 2: M.tb H37Ra ∆MRA_1161；
lane3: M.tb H37Ra ∆MRA_1161(hyg–sacB)
PCR结果表明，MRA_1161基因敲除突变株构建成功。目前MRA_1161是唯一已知的去乙酰基化蛋白质编码基因，乙酰化酶代谢可逆原因，免疫印迹分析结果表明MRA_1161基因缺失后，菌株乙酰化表达水平提高。
2. 敲除MRA_1161的影响
（1）菌落形态、生物膜的形成
突变株与野生株相比，菌落表面湿润，褶皱减少，趋于平滑。结果表明，去乙酰化酶编码基因MRA_1161缺失可引起结核分枝杆菌菌落形态发生改变。在液体培养条件下，发现突变株与野生株生物膜形成存在差异，野生株会在液体培养基表面形成一层白色薄膜，并沿瓶壁延伸，而突变株形成的薄膜非常微弱，并没有明显延伸。这一结果表明，去乙酰化酶编码基因MRA_1161缺失会导致结核分枝杆菌生物膜形成能力的缺陷。
（2）热击耐受性
蛋白修饰组学分析显示，有大量热休克蛋白存在乙酰化修饰，热休克蛋白与细菌对环境热压力相关。对突变株及野生株进行热击耐受性分析实验，将野生菌与敲除菌培养一定时间后，53℃水浴后稀释涂板，37℃培养25天后对菌体计数。结果如下图所示，与野生株相比，突变株热激1 h存活数目是野生株的100倍。结果说明，赖氨酸乙酰化可调节结核分枝杆菌热击反应，使菌株更耐受环境中的热压力。
（3）碳源利用
MRA_1161目前唯一已知的去乙酰基化蛋白质编码基因，乙酰化酶代谢可逆原因，基因缺失后会影响碳源利用。当葡萄糖成为唯一碳源时，突变株生长缓慢，当乙酸盐作为唯一碳源时，MRA_1161敲除突变株在不同浓度乙酸盐下的生长速率无明显变化。结果表明，赖氨酸乙酰化修饰影响结核分枝杆菌对葡萄糖的利用，对醋酸盐的利用影响不大。
乙酰化对HspX免疫原性影响
该研究中产生的乙酰基组数据显示，有45种乙酰化分泌蛋白可以刺激宿主的免疫反应。因此，检测了乙酰化是否影响分泌蛋白的免疫原性。
45种分泌蛋白中，结核分枝杆菌热休克蛋白X (HspX)有多个位点发生乙酰化。有证据表明结核分枝杆菌的HspX在宿主体内诱导有效的免疫应答，重组HspX蛋白免疫小鼠后，干扰素水平升高。
由于难以在体外制备乙酰化和去乙酰化全长HspX，合成了两个序列相同的30-mer肽段(HspX残基62-91)，其中一个序列的赖氨酸残基全部乙酰化(肽段A-6291)，另一个不含乙酰化（6291）。
收集26个病人的血样，ELISPOT分析比较A-6291和6291免疫原性。结果表明，其中三个样品（3、13、25）对肽6291免疫阳性，而13号样品对A-6291的免疫原性很弱，其它无免疫原性。这些结果表明，乙酰化作用影响其分泌蛋白的免疫原性。
a：阴性对照 ；b:6291；c:A-6291 ；d:阳性对照
小结
该研究利用免疫沉淀和高分辨率质谱技术，对结核分枝杆菌的乙酰化蛋白质及其赖氨酸乙酰化修饰位点进行了检测，共鉴定了137个乙酰化蛋白中的226个乙酰化位点。
对结核分枝杆菌乙酰化谱数据进行生物信息学分析，其中有127个乙酰化蛋白参与生理和代谢过程，包括TCA循环、脂肪酸等基本物质的代谢、菌体生长、应激反应等，尤其是热休克蛋白具有高度乙酰化修饰。结果显示，乙酰化修饰可能在碳源代谢、脂肪酸合成、应激反应等过程中发挥着重要作用。
通过噬菌体介导的同源重组方法，构建结核分枝杆菌H37Ra∆MRA_1161（NAH+依赖脱乙酰化酶），进一步对赖氨酸乙酰化蛋白质功能进行研究，结果表明蛋白乙酰化影响结核分枝杆菌的菌落形态、生物膜形成，同时可提高菌株耐受高温胁迫能力，降低对葡糖的利用。
ELISPOT实验结果表明，赖氨酸乙酰化可以抑制已知免疫原HspX产生的肽的免疫原性，这表明赖氨酸乙酰化在免疫原性中起调节作用。这些数据集是结核分枝杆菌赖氨酸乙酰化功能分析的重要资源，并有助于阐明这种危及生命的病原体的整个代谢网络。
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参考文献
[1] Fengying Liu, Mingkun Yang, Xudeng Wang, et al. Acetylome Analysis Reveals Diverse Functions of Lysine Acetylation in Mycobacterium tuberculosis. Mol Cell Proteomics.2014 Dec;13(12):3352-66.
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