晶诺生物技术服务

 

  1. 结核杆菌基因敲除技术服务

基因敲除技术原理:噬菌体介导的同源重组。DNA同源重组是指具有同源序列的DNA分子之间在同源重组相关蛋白参与下发生的遗传信息重组,根据这个原理可以对基因进行特异敲除。在待敲除基因两侧选取同源臂,两侧同源臂克隆到噬菌体包装载体筛选基因两侧后形成穿梭质粒,穿梭质粒电转到耻垢分枝杆菌中后可形成噬菌体,产生的噬菌体感染待敲除菌株后,由于同源臂的存在,会使质粒与待敲除菌株DNA发生同源重组,使筛选基因替换目的基因从而达到基因敲除的目的,敲除成功的菌株可以通过筛选基因进行筛选。

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  1. 结核杆菌基因过表达技术服务

技术原理与实验步骤:PCR扩增结核分枝杆菌目的基因,通过无缝克隆方法将目的基因整合到载体pMV261(游离型载体)或pMV361(整合型载体)多克隆位点处,抽提质粒并测序验证,获得的阳性质粒通过电转化方法转入野生型或基因敲除结核分枝杆菌中,利用载体上来源于结核分枝杆菌的hsp60基因启动子实现插入基因的表达。

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  1. 分子生物学技术服务

 

3.1 质粒构建

质粒是广泛存在于细菌、放线菌、酵母菌等生物中,赋予这些生物抗药、抗重金属等特性,对质粒进行有目的的改造后可以用于目的基因的片段扩增、目的基因的特异表达等,已经成为现代生物学必不可少的工具。质粒的构建主要用到常用的分子生物学实验如PCR、限制性核苷酸酶切、DNA连接酶连接、转化大肠杆菌感受态细胞等。

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3.2 定点突变

基因定点突变指在基因核苷酸序列特定位点插入或缺失核苷酸,是蛋白功能改造的常用方法。目前基因定点突变的方法主要有PCR介导的定点突变、寡核苷酸引物介导的定点突变、盒式突变等。

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3.3 DNA Shuffling技术

DNA Shuffling技术最早由Stemme于1994年提出,是将多种类型的具有同源序列的DNA混合后经DNase或超声波处理后随机断裂成小片段寡核苷酸片段,不加引物使同源片段互为模板进行PCR,PCR后纯化回收后作为DNA模板,加引物做常规PCR后得到突变后的目的DNA,DNA Shuffling实现DNA分子的进化,可用于蛋白、酶、抗体、细胞因子、工程菌的优化。

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3.4 SNP检测

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP)是指基因组上单个核苷酸的变异,人类基因组平均每1000个就有一个SNP。它是由基因组DNA某一特定核苷酸位置上单个碱基的转换、颠换、插入或缺失引起的点突变,使得群体之间和个体之间产生了差异。其中转换和颠换发生频率较高,转换是指同型碱基之间的转换,即嘌呤与嘌呤、嘧啶与嘧啶间;颠换是指发生在嘌呤与嘧啶之间的替换。SNP可用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等,应用广泛。

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  1. 蛋白生物学技术服务

 

4.1 原核表达

将目的基因片段连接至合适的原核表达载体后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株内,随后利用菌自身的蛋白表达系统通过温度和诱导剂的控制,诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质,将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。原核表达系统是远今为止最为成熟可靠的蛋白表达系统,其优点是实验周期短、成本低、产量高。

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4.2 蛋白免疫沉淀

蛋白免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)是一种研究蛋白质间交互作用的生物技术,这种技术是将蛋白质视为抗原,加入相对应的抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后,再与蛋白A/G(ProteinA/G)或二抗偶联的agarose或Sepharose珠子孵育,通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物,从而达到分离和浓缩出特定蛋白质的目的。

蛋白免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白,那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。再通过蛋白变性分离,对B蛋白进行检测,进而证明两者间的相互作用。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的,符合体内实际情况,得到的结果可信度高。

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4.3 EMSA

凝胶迁移实验又称凝胶阻滞实验或电泳迁移率实验(EMSA,electrophoretic mobility shift assay),是一种用于研究蛋白与核酸相互作用的技术。这项技术是基于DNA/蛋白质或RNA/蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中有不同迁移率的原理,当蛋白与一条人工标记后的DNA或RNA结合后,其在PAGE中的迁移率将小于未结合蛋白的DNA或RNA,从而检测到蛋白与DNA或RNA结合。DNA与RNA可通过32P同位素标记,但是由于放射性因素,实验时间和安全性都不方便实验开展;现在一般通过生物素标记DNA或RNA,通过化学发光法检测。另外,也可不对DNA标记,DNA与蛋白结合后直接用含有SYBR Green染料的loading buffer进行琼脂糖凝胶电泳。

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4.4 Western blot实验

免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(western blot),它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法,具有高分辨力、高特异性和敏感性,是蛋白分析的一种常规技术,可常用于鉴定某种蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析。蛋白经过PAGE凝胶电泳及转膜后,添加一抗可与蛋白特异结合,加入标有辣根过氧化物酶的二抗可与一抗结合,最后通过与加有底物的显色液反应,通过化学发光或胶片显色达到检测蛋白的目的。

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4.5 Elisa实验

酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay)(简写ELISA)指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上,利用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接,然后通过酶与底物产生颜色反应,定量测定抗原或抗体,具有快速、灵敏、简便等优点。检测抗原常用的方法是双抗体夹心法,检测抗体常用的方法是间接法,竞争法即可测抗原也可测抗体。

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  1. 细胞因子生物学活性检测技术服务

细胞因子作为重要的蛋白药物,可以通过原核表达和真核表达纯化系统得到。蛋白纯化后的生物学活性是检测蛋白功能的重要指标,对蛋白的后续应用有重要影响。测定细胞因子生物学活性的方法可分为细胞增殖和增殖抑制法、细胞毒活性测定法、抗病毒活性测定法、趋化活性测定法、ELISA法等,不同的细胞因子生物学活性检测的方法不同。晶诺生物建立了专门的细胞因子活性测定细胞库,有经验丰富的专业人员,客户提供蛋白、血液等样品,可为客户提供相关技术测活服务。

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  1. 慢病毒包装

慢病毒感染是构建稳转细胞株的常用技术,目前大部分所用的慢病毒包装体系是基于人类免疫缺陷病毒(HIV-1)进行改造的,一般包括表达质粒及包装质粒,目的基因克隆到表达载体上后,与包装质粒共同用转染试剂如PEI等转染到293T细胞或293FT细胞中,对分裂期细胞及非分裂期细胞均具有很高的感染效率,病毒包装滴度高、感染细胞效率高、外源基因表达效率高。

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  1. 稳转细胞株构建

稳转细胞株构建一般是通过慢病毒方法构建的。构建慢病毒包装需要的表达质粒及包装质粒,用转染试剂将质粒转染到293T等病毒包装细胞中可完成病毒包装。包装好的慢病毒感染细胞后,会将目的表达基因整合到细胞基因组中,实现稳定表达,通过表达载体上的筛选基因如荧光、抗生素等可实现阳性细胞筛选。本公司拥有荧光蛋白Venus、mCherry、mKate、GFP、EYFP等质粒,运用慢病毒包装系统包装慢病毒,感染CHO、Hela、客户需求细胞,可构建用于检测基因表达、蛋白定位相关的荧光蛋白融合细胞株及检测蛋白相互作用及药物筛选的双分子荧光互补细胞株。

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  1. Crispr-Cas9基因敲除

CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是基因敲除领域的重大新技术,由细菌和古细菌针对外源基因的获得性免疫防御机制的启发,设计转录后能与基因组特定核苷酸序列互补配对的gRNA指导Cas核酸酶进行基因定向修饰,在靶定位点剪切双链DNA,随后通过宿主自身的DNA修复机制修复,从而达到修饰基因组DNA的目的。在人、鼠、猴、植物、细菌等多种生物中广泛应用。

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