外泌体概述

| 外泌体的发现

网织红细胞成熟为红细胞的过程中,细胞密度逐渐增加,细胞膜相关成份含量逐渐下降,这些含量减少的细胞膜成份究竟去了哪里是网织红细胞分化机制中的一个谜题。

Rose M. Johnstone等最初发现羊网织红细胞成熟过程中转铁蛋白受体逐渐减少,其是通过分泌一种囊状小泡完成,随后通过高速离心获取囊状小泡,对其成份分析表明这种囊泡含有乙酰胆碱酯酶、葡萄糖转运体、核苷转运蛋白、钠离子非依赖的氨基酸转运蛋白、转铁蛋白受体、鞘磷脂等典型网织红细胞、红细胞的细胞膜成份,这种被分泌的囊泡结构被定义为外泌体(exosome),由多泡体( MVB) 通过膜内陷包裹内容物形成并在多泡体与细胞膜融合的过程中被释放到胞外[1]

| 外泌体来源及内含物

最初研究表明代谢能力低的细胞或成熟细胞不分泌外泌体,目前越来越多的研究发现T/B 淋巴细胞、树突状细胞、肥大细胞、神经细胞、脂肪细胞、内皮细胞及肿瘤细胞等都可分泌外泌体。外泌体直径在30-150nm之间,富含具有外泌体膜交换以及融合作用的膜联蛋白、富含参与外泌体运输的四跨膜蛋白家族等,还富含胆固醇和鞘磷脂等脂类及mRNA、microRNA等核酸分子。

不同的细胞分泌的外泌体成份不同,如不成熟树突状细胞的外泌体中含有乳凝集素、结肠上皮细胞的外泌体中含有A33等。还有一些外泌体中的蛋白包括多种的代谢类的酶(GAPDH、烯醇化酶1、醛缩酶1、PKM2、PGK1、PDIA3、GSTP1、DPP4、AHCY、TPL1、抗氧化蛋白、P4HB、LDH、亲环素A、FASN、MDH1和CNP)、核糖体蛋白(RPS3)、信号转导因子(黑色素瘤分化相关因子、ARF1、CDC42、人类红细胞膜整合蛋白、SLC9A3R1)、粘附因子(MFGE8、整合素)、细胞骨架蛋白以及泛素等。

| 外泌体生理学功能

外泌体的生理学功能多种多样,由其来源细胞决定。外泌体功能包括参与运输遗传物质、进行细胞间信息交流、进行信号转导、调节免疫反应(免疫抑制和免疫监控)等。

外泌体靶向细胞的方式主要有三种:一是识别细胞表面的特异性受体;二是直接与靶细胞细胞膜融合;三是通过内吞作用在靶细胞内发挥作用。

外泌体所含的成份影响靶细胞,改变靶细胞功能,如包裹mir-155巨噬细胞来源的外泌体能通过体液运输作用于心脏成纤维细胞,抑制Sos1基因表达导致成纤维细胞复制受阻,促进Socs1表达进而促进炎症发生,最终导致心肌梗死[2];人脐带间充质干细胞产生的外泌体富含大量IL-6、IL-8等细胞因子,可以促进靶细胞增殖,并能通过激活ERK1/2和p38信号通路蛋白来保护细胞因氧化应激而导致的细胞凋亡等等[2]


外泌体形成及与靶细胞作用方式

| 外泌体制备及应用

不同细胞内包含的物质各不相同,其分泌的exosome的内容物也会存在差异,寻找exosome中组织特异性的分子标志物并比较疾病和健康状态下的差异将在临床疾病诊断过程中具有广阔的应用前景。人的血液、尿液、唾液、胸腹水、乳汁、脑脊液、肺泡灌洗液等体液中都可检出外泌体,超速离心法、蔗糖/碘克沙醇密度梯度离心法、商品化试剂盒ExoQuickTM、Total Exosome IsolationTM、磁珠分选法等能够用于外泌体的提取制备,方便肿瘤、炎症、心脏病、结核病等多种疾病诊断、发病机制、疾病治疗药物等研究工作开展。

现在已经有生物公司尝试涉足外泌体领域,如检测胰腺癌癌细胞外泌体中所包含的一种蛋白Glypican-1,这种蛋白有可能作为一种非侵入性诊断和筛查处于适合手术治疗阶段的早期胰腺癌;又如全球首个基于外泌体RNA的液态活检产品-ExoDx Lung(ALK),是一种基于血浆外泌体的诊断产品,可准确检测非小细胞肺癌患者的EML4-ALK突变;外泌体中存在的黑色素瘤标志物包括MIA、S100B和酪氨酸酶相关蛋白2,且黑色素瘤患者胞外体中MIA和S100B浓度显着高于健康人群和非黑色素瘤患者,通过检测MIA和S100B表达水平对黑色素瘤的诊治具有积极地参照作用。寻找不同疾病人群中外泌体标志物,将促进疾病诊断研究及诊断产品开发。

 

外泌体与结核分枝杆菌

结核病由结核分枝杆菌感染引起,是危害世界公共健康的严重疾病之一,其致病机制非常复杂,需要进行深入研究。结核病诊断是控制结核病传播的重要手段,基于外泌体在疾病诊断中的潜力,寻找结核分枝杆菌携带者、结核病患者唾液、尿液、脑脊液、胸腔积液等外泌体中结核相关标志物(痰液是结核病诊断的重要成份,能不能用于制备外泌体还是未知,有待尝试)可能会大大促进结核诊断;另外,制备相关外泌体,分析相关的蛋白、脂类、RNA等成份,可能有助于了解结核分枝杆菌抑制细胞免疫、促进巨噬细胞上皮化、肉芽肿形成机制等结核病发病机制相关研究,也可能直接用于结核病治疗。

| 结核分枝杆菌与外泌体成份

鸟结核分枝杆菌感染巨噬细胞后形成的外泌体中含有其糖脂类成份(glycopeptidolipids,GPLs),这些外泌体可以从被感染的巨噬细胞转移到未被感染的巨噬细胞中并导致巨噬细胞炎症发生,该炎症的产生依赖TLR2、TLR4受体,说明外泌体中可能含有TLR2、TLR4相关配体[3]

与鸟结核分枝杆菌类似,BCG菌株感染巨噬细胞的外泌体中含有脂阿拉伯甘露聚糖、19-kDa脂蛋白等成份,外泌体能与未被感染巨噬细胞作用,促进其TNFα表达[4];被BCG感染的巨噬细胞分泌的外泌体能促进CD4+、CD8+ T细胞的增殖,但是外泌体中含有的结核相关抗原成分并不完全清楚,Pramod K. Giri等人用H37Rv及H37Rv培养滤液感染J774细胞,收集J774细胞产生的外泌体并用液相-质谱检测其蛋白成份,发现J774外泌体中含有ESAT-6、Ag85复合体、MPT63、MPT64等抗原,这些外泌体能活化巨噬细胞、树突状细胞并激活CD4+、CD8+ T细胞免疫,具有作为抗结核疫苗的潜力[5]

结核分枝杆菌H37Rv培养滤液感染J774细胞外泌体结核相关蛋白成份

另外,结核分枝杆菌感染宿主细胞后产生的外泌体中还含有RNA,如Shamila D. Alipoor等用BCG感染MDM (monocyte-derived macrophage)细胞,72h后收集外泌体中的RNA并做RNA测序,去除测序原始数据中的引物等测序引物信息后与人miRNA数据库miRBase比对,后用miRDB、KEGG等分析RNA功能,发现外泌体中含有miR-1224、miR-1293、miR-425、miR-4467、miR-4732、miR-484、miR-5094、miR-6848-6849、miR-4488、miR-96等与代谢及能量生成相关的miRNA[6]

张等人对临床上健康人(HC)、潜伏感染结核患者(LTBI)及活动性肺结核患者(ATB)血清中的外泌体中的RNA进行测序,并对测序数据进行 GO、Ingenuity Pathway Analysis(IPA)等功能分析,发现HC、LTBI、ATB血清外泌体中分别有18913、18882、18962个编码基因的转录产物;LTBI转录产物总含量比HC、ATB高,且含有较多的lncRNA;ATB假基因非加工RNA产物高于LTBI;HC、LTBI、ATB三组相比,HC有1188个基因表达含量高于LTBI、ATB,LTBI有1020个基因表达水平高于其他两组,ATB有681个比其他两组高;GO分析表明ATB 681个高表达基因中有12个基因与脂类代谢相关,与结核分枝杆菌利用宿主细胞脂类报道结果相符,14个基因如19α1、1α2等与肉芽肿形成相关。张等人还对这些样本中的表达量上升、表达量下降的基因进行了统计与比较,在此不做过多分析。

该研究中,研究人员还发现正常人的外泌体中含有结核分枝杆菌rrs、rrl 两种核糖体RNA基因产物,ATB外泌体中含有rrs、rrl、Rv2917 三种,LTBI中含有1101个结核分枝杆菌基因编码产物,LTBI的这1101个基因产物中含量较高的前20个(包括PPE家族、转座酶、pks家族等)对结核分枝杆菌免疫调控及毒力有重要影响[7]

正常人中为何会有结核分枝杆菌rrs、rrl 基因编码产物而无其他结核分枝杆菌基因,Rv2917 基因在结核分枝杆菌中的功能如何都是一些比较有趣的问题。

HC、LTBI、ATB外泌体中结核分枝杆菌相关RNA功能分析

 

外泌体在结核分枝杆菌研究领域应用

1、结核病诊断:耐药结核、活动性肺结核、潜伏结核感染等;

2、结核病致病机制研究:结核分枝杆菌如何抑制宿主免疫系统等;

3、结核病疫苗研究:结核分枝杆菌感染宿主后产生的外泌体能激活宿主巨噬细胞、T细胞、B细胞等免疫细胞,可能是疫苗研究的方向之一;

4、结核病药物开发:根据结核分枝杆菌感染宿主后生成的外泌体,发现重要的相关分子如外泌体与靶细胞结合相关蛋白、外泌体中结核分枝杆菌毒力蛋白及RNA等,针对这些分子进行药物筛选并开发为治疗结核病的药物。

 

参考文献

1. Johnstone RM, Adam M, Hammond JR, Orr L, Turbide C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes). J Biol Chem. 1987 Jul 5;262(19):9412-20.

2. 外泌体及其在结核病中作用的研究进展。伊星昊,李猛,付玉荣。中国病原生物学杂志,2018年2月 第13卷第2期。

3. Bhatnagar S, Schorey JS. Exosomes released from infected macrophages contain Mycobacterium avium glycopeptidolipids and are proinflammatory. J Biol Chem. 2007 Aug 31;282(35):25779-89.

4. Bhatnagar S, Shinagawa K, Castellino FJ, Schorey JS. Exosomes released from macrophages infected with intracellular pathogens stimulate a proinflammatory response in vitro and in vivo. Blood. 2007 Nov 1;110(9):3234-44.

5. Giri PK, Kruh NA, Dobos KM, Schorey JS. Proteomic analysis identifies highly antigenic proteins in exosomes from M. tuberculosis-infected and culture filtrate protein-treated macrophages. Proteomics. 2010 Sep;10(17):3190-202.

6. Alipoor SD, Mortaz E, Tabarsi P, Farnia P, Mirsaeidi M, Garssen J, Movassaghi M, Adcock IM. Bovis Bacillus Calmette-Guerin (BCG) infection induces exosomal miRNA release by human macrophages. J Transl Med. 2017 May 12;15(1):105.

7. Lv L, Li C, Zhang X, Ding N, Cao T, Jia X, Wang J, Pan L, Jia H, Li Z, Zhang J, Chen F, Zhang Z . RNA Profiling Analysis of the Serum Exosomes Derived from Patients with Active and Latent Mycobacterium tuberculosis Infection. Front Microbiol. 2017 Jun 12;8:1051.

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