结核病由结核分枝杆菌引起,是严重威胁世界公共卫生的疾病之一。

结核分枝杆菌侵染人体时,会面临巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞等先天免疫细胞防御,这些细胞表达的Toll样受体(TLRs,Toll-like receptors)、Nod样受体(NLRs,Nod-like receptors)、C型凝集素受体(CLRs,C-type lectin receptors)等受体能够识别结核分枝杆菌、介导结核分枝杆菌进入宿主细胞,并激活宿主免疫细胞的吞噬、自噬、炎性反应、细胞凋亡等病原体杀伤相关信号通路。

然而,结核分枝杆菌在与宿主免疫对抗过程中进化出了多种逃逸免疫杀伤的机制,如抑制细胞抗菌肽的生成、阻碍吞噬体的成熟、调控细胞自噬等。结核分枝杆菌与宿主免疫对抗平衡会使宿主形成肉芽肿结构,宿主免疫力下降时会导致肉芽肿破损、细胞坏死及炎症细胞募集。对结核分枝杆菌与宿主细胞间相互作用机制深入研究,有助于抗结核药物及疫苗的研发。

结核分枝杆菌感染宿主过程中,巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞等免疫细胞会发生免疫应答,黏膜相关不变T细胞(mucosal associated invariant t cells)、CD1淋巴细胞、自然杀伤T细胞(NKT)等先天免疫样细胞及呼吸道上皮细胞等非免疫细胞也参与宿主对抗结核分枝杆菌感染过程,这些细胞发挥不同功能并可能被结核分枝杆菌调控。

 

1. 巨噬细胞(Macrophages)

 

Macrophages | wikipedia

巨噬细胞是结核分枝杆菌感染、复制的主要场所,在结核病发生过程中扮演重要角色。结核分枝杆菌能够首先被肺泡巨噬细胞吞噬,这依赖于结核分枝杆菌的糖脂、脂蛋白、糖类等分子与宿主细胞的TLR、NLR、CLR等受体的相互作用,这些分子-受体相互作用能影响宿主细胞基因如IFN-γ、IL-12、IL-1β、CCL3等表达变化并影响宿主细胞命运。比较典型的例子是巨噬细胞的M1、M2分型,M1型巨噬细胞由LPS及GM-CSF、IFN-γ、TNFα等细胞因子诱导巨噬细胞形成,发挥抗菌功能并释放免疫应答因子;M2型巨噬细胞由IL-4、IL-10、IL-13、TGFβ等诱导巨噬细胞产生,抗原呈递能力弱,抑制Th1免疫应答。

巨噬细胞的M1、M2分型

M1、M2型巨噬细胞对结核分枝杆菌命运起着重要调控功能,如缺失M2型细胞标志蛋白Arg1的小鼠对结核分枝杆菌抵抗能力增强、活动性肺结核病人的单核细胞倾向分化为M2样巨噬细胞。另一种典型的细胞是骨髓样抑制细胞等类型的细胞,这些细胞可分泌IL-10、TGFβ等,抑制免疫应答,保证结核分枝杆菌的存活。结核分枝杆菌面对巨噬细胞等细胞的免疫,可通过分枝菌酸、分泌ESAT-6、调控TLR2信号通路、调控巨噬细胞代谢等影响巨噬细胞命运,如分枝菌酸、ESAT-6可促使泡状巨噬细胞生成,泡状巨噬细胞吞噬能力下降、抗原呈递能力减弱、能分泌TGFβ。深入研究结核分枝杆菌影响巨噬细胞的机制,寻找新的方法调控巨噬细胞分型、代谢等是治疗结核病的新思路。

 

2. 树突状细胞(Dendritic cells)

 

Dendritic cells | wikipedia

树突状细胞在结核分枝杆菌抗原呈递过程中发挥重要功能,在先天免疫与后天免疫之间起着关键桥梁作用。单核细胞分化的树突状细胞表达甘露糖受体(MRs,mannose receptors)、树突细胞C型凝集素受体(DC-SIGN,DC-specific ICAM-grabbing nonintegrin),受体能识别结核分枝杆菌脂蛋白lprG、六甲基磷脂醇(PIMs,hexamannosylated phosphatidylinositol mannosides),比如结核病人淋巴结处CD14 ( − ) HLA-DR (+) DC-SIGN (+)细胞中就可以检测到结核分枝杆菌,表明树突状细胞能影响病原菌持久性及宿主免疫。

Roberts及其同事发现被结核分枝杆菌感染的树突状细胞CD18表达量下降,树突状细胞迁移到淋巴结处的能力减弱。BCG感染实验证明了有一类树突状细胞能影响CD4+ T细胞的启动,依赖IL-1R-MyD88途径将BCG转送到淋巴结处。结核分枝杆菌带甘露聚糖帽的脂阿拉伯甘露聚糖(ManLAM,mannose-capped lipoarabinomannan)与树突状细胞DC-SIGN结合会使树突状细胞分泌IL-10,IL-10能阻止树突状细胞成熟及免疫应激因子释放。ManLAM与DC-SIGN的结合还能抑制IL-12的表达,表明结核分枝杆菌能通过调控树突状细胞阻止获得性免疫良好发挥功能。

结核分枝杆菌PE27能与树突状细胞TLR4受体结合,激活下游ERK、MAPK、NF-κB等信号通路,促进树突状细胞成熟,激活Th1型特异性免疫应答,是结核疫苗研究靶点之一。结核分枝杆菌RpfE能促进树突状细胞分泌IL-6、IL-1β、 IL-23p19、IL-12p70 、TNF-α等,促使树突状细胞成熟,也是结核疫苗研究靶点之一。NEDD8、SENP8能影响树突状细胞活性氧爆发、细胞凋亡、细胞自噬,结核分枝杆菌Rv2463、Rv3416能降低树突状细胞NEDD8但上调SENP8表达,表明结核分枝杆菌能通过类泛素化途径保证其在宿主细胞中的长期存活。结核分枝杆菌感染树突状细胞后,树突状细胞CD13表达量升高,CD13抗体处理能增强T细胞免疫,表明CD13对结核分枝杆菌生长有利,但是结核分枝杆菌如何通过CD13发挥功能的机制还是未知,更多的关于结核分枝杆菌调控树突状细胞的研究仍需深入开展。

 

3. 中性粒细胞(Neutrophils)

 

Neutrophils | wikipedia

中性粒细胞是结核分枝杆菌感染后第一种渗透到肺部的细胞类型,在结核患者的支气管灌洗液及痰液中也是数量最多的细胞种类,它们在结核病理发生过程中起着非常复杂的功能。

不同的细胞因子、趋化因子、警报素家族蛋白(alarmins)、miRNA等能招募中性粒细胞进入肺部或调控其功能。中性粒细胞在呼吸爆发时会分泌人弹性蛋白酶(elastase)、胶原蛋白水解酶(collagenase)、骨髓过氧化物酶(myeloperoxidase)等,这些酶能起到杀伤病原菌的作用。中性粒细胞也可以分泌精氨酸酶、基质金属蛋白酶-9、明胶酶 B等可以破坏肺薄壁的酶类,其分泌可能受结核分枝杆菌感染的免疫细胞及上皮细胞影响。中性粒细胞在抵抗结核分枝杆菌感染过程中发挥重要功能,研究表明结核病患者血液中的中性粒细胞与结核病病程呈负相关,血液中中性粒细胞减少会导致结核分枝杆菌自由生长,死亡的中性粒细胞或中性粒细胞微粒中含有的抗菌肽物质能被巨噬细胞吸收并抑制结核分枝杆菌复制。结核病患者血液中的细胞程式死亡-配体PD-L1蛋白主要来自于中性粒细胞表达,PD-L1与细胞程序化死亡受体PD-1结合能抑制CD8+ T细胞增生,抑制免疫;CD73能抑制结核分枝杆菌感染早期中性粒细胞进入肺部;结核分枝杆菌ESAT6蛋白能诱导中性粒细胞Ca2+超负荷,并引发细胞坏死。这表明结核分枝杆菌可以通过多种机制调控中性粒细胞,但是结核分枝杆菌中相关的调控分子还不清楚。

 

4. 自然杀伤细胞(Natural killer cells)

 

NK cells | web

自然杀伤细胞具有溶解细胞功能,其发挥功能不依赖MHC。自然杀伤细胞NCR受体识别结核分枝杆菌的不同成份如分枝菌酸,溶解被结核分枝杆菌感染的细胞。NK细胞能对抗结核分枝杆菌感染,可通过间接激活巨噬细胞,分泌含有穿孔素(perforin)、粒子素(granulysin)、粒酶(granulysin)等成份的细胞质颗粒溶解细胞,分泌IFNγ、IL22促进吞噬体-溶酶体融合,分泌CD54、TNFα、GMCSF、IL12等促进γδT细胞增殖,通过多种机制抑制结核分枝杆菌生长。研究表明,结核病患者的NK细胞功能会发生缺失,如NCR受体表达量降低等。抗结核药物治疗能部分恢复NK细胞功能;NK细胞、谷胱甘肽(GSH)在HIV病人中含量降低,GSH能作为抑菌剂抑制结核分枝杆菌生长,可作为治疗HIV与结核病并发症患者的辅助治疗手段。

结核分枝杆菌需要被免疫细胞受体识别才能激活宿主免疫系统并被吞噬。目前已报道的识别结核分枝杆菌的受体有TLR(Toll-like receptors)、NLR(Nod-like receptors)、CLR(C-type lectin receptors)、CD14、AIM2、AhR、清道夫受体(scavenger receptor, SR)等,不同细胞表达的受体不同,特定细胞能利用一种或多种受体与结核分枝杆菌结合。

 

1. TLR信号通路

Toll样受体同源分子都是Ⅰ型跨膜蛋白,可分为胞膜外区、胞浆区和跨膜区三部分。Toll样受体胞膜外区主要行使识别受体及与其他辅助受体(co-receptor)结合形成受体复合物的功能。Toll样受体的胞浆区与IL-1R家族成员胞浆区高度同源,该区称为Toll-IL-1受体结构域(Toll-IL-1 receptor domain,TIR结构域)。TIR具有嗜同性相互作用(homophilic interaction),借此来募集下游含有TIR的信号分子,组成信号复合体。

但是二者胞外部分不相同,TLR胞膜外区为有17-31个亮氨酸富集的重复序列(Leucine rich repeats,LRRs),并且都含有3个胞外段辅助蛋白即MD-1、MD-2和RP105,参与对疾病相关分子模式(PAMP)的识别;而IL-1R为Ig样的结构。在哺乳动物中,一些胞浆蛋白也存在TIR域,如MyD88、含TIR域接受子蛋白(TIR domain-containing adaptor protein,TIRAP)、TRIF、TRAM等,这些蛋白在TIR信号传导中起作用。TLR家族成员有11个,根据TLR蛋白定位及识别底物可分为细胞膜锚定TLR(plasma membrane-anchored TLRs)及内体TLR(endosomal TLRs)两大类。

TLR家族成员

不同的TLR识别病原体后,会招募不同的蛋白分子,激活下游不同的信号通路如MAPK、PI3K/AKT、NF-κB等,促使细胞分泌抗炎因子、干扰素等。如TLR2能识别结核分枝杆菌lpqH 基因表达的脂蛋白,TLR3调控结核分枝杆菌RNA介导的IL10生成。

结核分枝杆菌蛋白可通过调控TLR信号通路影响被感染细胞命运,如结核分枝杆菌Lrp能抑制TLR2激活的PI3K/AKT信号通路而抑制抗炎因子生成及巨噬细胞抗原呈递,结核分枝杆菌PtpA、Mce3E蛋白调控MAPK、NF-κB信号通路。有趣的是,有报道GPR160也能够通过MAPK/ERK信号通路调控结核分枝杆菌进入巨噬细胞,表明GPCR与TLR信号通路可能发挥协同作用。

TLR表达及活化状态可以作为结核病人免疫状况的指标,如缺失TLR适配蛋白Myd88的小鼠对结核分枝杆菌感染更为敏感,TLR2基因缺失也会出现同样现象,TLR2、TLR4、TLR7、TLR8等基因多态性被报道与结核分枝杆菌易感性相关。但是TLR信号通路是否具有抵抗结核分枝杆菌功能存在争议,如有研究报道Myd88而非TLR在激活巨噬细胞反应中发挥关键作用,细胞因子的释放也不依赖TLR等。

 

2. NLR信号通路

NLR家族包括NOD1、NOD2、NLRP3、NLRC4等蛋白,位于细胞质,能识别病原菌成份并激活炎症信号通路,保护机体免受病原体危害。NOD2基因敲除研究表明NOD2有助于细胞抵抗结核分枝杆菌感染,NOD2能被胞壁酰二肽激活并促进自噬,NOD2基因多态性与结核分枝杆菌易感性相关,这些研究表明NOD2在对抗结核分枝杆菌中发挥重要保护功能。

结核分枝杆菌ESAT6能NLRP3/ASC炎性体生成,导致IL-1β释放及细胞焦亡;对小鼠基因基因编辑使小鼠生成IL-1β或对IL-1β反应存有缺陷 ,用结核分枝杆菌感染这种小鼠后小鼠会表现出急性发病表型,但是该表型的出现不依赖TLR、NLRP3、ASC等,可能是由于在某些情况下结核分枝杆菌诱导炎性体有助于其在宿主细胞中长期存活。

 

3. CLR信号通路

CLR为跨膜蛋白,可分为17种类型,包括MR、DC-SIGN、Mincle、Dectin-1、Dectin2、Dectin3、CL-LK、DCIR等。CLR存在至少一个碳水化合物识别结构域,可结合糖类、脂类、蛋白、离子等。结核分枝杆菌配体如ManLAM、索状因子(cord factor)等能被至少一种CLR识别,如ManLAM能被MR、DC-SIGN、Dectin2、CL-LK识别,海藻糖二霉菌酸酯(TDM, trehalose 6, 6′-dimycolate)能被Mincle识别,Dectin3能调控Mincle表达,DCIR能维持I型干扰素信号通路但配体不明。

结核分枝杆菌免疫相关细胞、受体及结核分枝杆感染后细胞命运[1]

 

结核分枝杆菌感染细胞后,细胞会释放炎症因子、趋化因子等,细胞能通过自噬、细胞凋亡、炎性体等过程控制或清除结核分枝杆菌并呈递抗原,最终使宿主具有适应性免疫。然而,结核分枝杆菌可以通过不同蛋白调控细胞不同信号通路,影响适应性免疫的产生。

 

1. 吞噬作用

结核分枝杆菌通过吞噬作用进入细胞后,能通过多种途径抑制吞噬泡的成熟,逃脱被溶酶体降解的命运。结核分枝杆菌PIMs促进早期溶酶体与吞噬泡的融合并阻止吞噬泡成熟,Rab14、小GTPase能被结核分枝杆菌募集并参与融合过程,然而具体机制还不清楚;ManLAM能与MR结合,抑制吞噬泡成熟;结核分枝杆菌能维持TACO蛋白存在于吞噬泡细胞质面,但是正常情况下吞噬泡与溶酶体融合过程中会快速丢失该蛋白;结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸激酶PknG、酪氨酸磷酸酶PtpA都能抑制吞噬泡与溶酶体融合。结核分枝杆菌在吞噬泡低pH条件下,能通过phoPR系统调控 aprABC 表达,改变结核分枝杆菌细胞壁脂类,保证其在酸性条件下存活。

然而,细胞对结核分枝杆菌感染也能够反抗,如细胞IFITM蛋白能与v-ATPase结合,维持其在内体膜上的稳定,促进内体成熟,抑制结核分枝杆菌生长。

另外,结核分枝杆菌一些蛋白也能够激活宿主细胞免疫,如结核分枝杆菌PPE57能结合TLR2,促使巨噬细胞表达CD40、CD80、CD86、MHC-I等,促进巨噬细胞活化,升高TNFα、IL6、IL-12p4表达量,是抗结核疫苗研究潜在靶点。

 

2. 细胞自噬

细胞自噬(autophagy)是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。该过程中一些损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后,送入溶酶体(动物)或液泡(酵母和植物 )中进行降解并得以循环利用。

饥饿、IFNγ、雷帕霉素等能使被结核分枝杆菌感染的细胞发生自噬,在自噬过程中,包被有病原菌的囊泡获得溶酶体相关标志蛋白并逐渐酸化。LPS也能引发被结核分枝杆菌感染细胞自噬,使定位于自噬小体中的结核分枝杆菌数量增加,自噬功能缺失的模型小鼠对结核分枝杆菌感染更为敏感,说明自噬是抵抗结核分枝杆菌的方式之一。缺乏自噬机制的动物对结核分枝杆菌感染敏感,体内的结核分枝杆菌不受控的分裂,机体释放更多的炎症因子并且有大面积局部肺脓肿。IRGM基因编码自噬相关GTP结合蛋白,其启动子区基因多态性与结核分枝杆菌易感性相关;活动性肺结核及潜伏性肺结核患者的IRGM基因不同,IRGM可能与潜伏性肺结核转化为活动性肺结核过程。结核分枝杆菌分泌的ESAT6能插入到吞噬泡膜上并破坏吞噬泡,能被适配蛋白如NDP52、p62等识别,促使LC3与破损吞噬泡结合并形成自噬体,成功将结核分枝杆菌包被到自噬体中;C-di-AMP是结核分枝杆菌的一种第二信使,也能够引起宿主细胞自噬。

当自噬不是由饥饿或其他外界因素引起的时候,结核分枝杆菌也可利用Rab GTPase及自噬,为其提供理想的复制场所,保证其在宿主细胞中的存活。结核分枝杆菌感染早期,可以募集Rab5,选择性的去除晚期内体蛋白Rab7、LAMP1,抑制吞噬泡与溶酶体的融合。Rab22a能抑制吞噬泡募集Rab7;EEA1参与吞噬泡成熟,其募集过程也被改变;Rab10先于Rab5被募集,也参与阻止吞噬泡与溶酶体融合。

结核分枝杆菌利用多种蛋白抑制吞噬体成熟,如Eis蛋白能直接乙酰化c-JNK抑制ROS、自噬及吞噬体成熟,也可通过Ac-H3上调IL10的表达并激活Akt/mTOR/p70S6K信号通路;SapM、LrpG、PDIM等都能够抑制吞噬体成熟并阻止吞噬体与溶酶体融合。Atg5能够阻止多态核细胞介导的免疫作用,起到保护结核分枝杆菌作用,Atg5基因缺失细胞对结核分枝杆菌感染更为敏感。

自噬既可以抗菌,也能起到抗炎功能,自噬是治疗结核病的研究方向之一,但是自噬时空调控机制仍需深入研究。

 

3. 细胞凋亡

细胞凋亡涉及一系列复杂的成份及信号通路,与细胞坏死不同,是一种自发的并受到调控的过程,能起到抵抗结核分枝杆菌的功能。细胞凋亡主要分为外源性凋亡及内源性凋亡两种。外源性凋亡是特异性配体与细胞膜死亡受体结合后,激活相关凋亡通路引起;内源性凋亡是细胞内不同的信号分子作用,最终使线粒体中的分子如细胞色素c等的释放并导致细胞凋亡。除了能抗结核分枝杆菌,细胞凋亡在机体获得性免疫发生过程中也扮演着重要角色,普遍观念认为结核分枝杆菌能阻止细胞凋亡并诱发细胞坏死从而逃脱或延迟抗原被呈递。

TLR家族参与结核分枝杆菌感染引起的细胞凋亡,如:

  • LpqH依赖TLR2引起细胞凋亡;
  • PE9/PE10依赖TLR4引起细胞凋亡;
  • TRIM27通过促进JNK/p38 MAPK 信号通路限制结核分枝杆菌存活;
  • 而PtpA能与TRIM27 RING结构域结合并使其丧失功能。

研究结核分枝杆菌调控细胞凋亡机制有助于开发新的治疗结核病的方法。

 

4. 炎性体

病原菌感染细胞过程中,NLR家族蛋白如NLRP3、NLRC4能与细胞质DNA感应蛋白AIM2组装炎性体复合体,炎性体复合体能介导激活caspase-1,caspase-1能导致促炎因子IL-1β、IL-18的成熟并诱发细胞焦亡。

NLRP3、AIM2等含有pyrin结构域的蛋白通过含有CARD结构域的ASC(apoptosis-associated specklike protein containing a CARD蛋白传递信号招募caspase-1,而含有CARD结构域的NLRC4能直接将信号传递给caspase-1并诱发细胞焦亡。

ESX-1分泌系统能激发IL-1β成熟,EsxA能激活NLRP3介导的炎性体生成,钾离子流、Nek7也都参与NLRP3介导的炎性体生成。AIM2参与形成的炎性体能被认为识别结核分枝杆菌,AIM2能直接识别结核分枝杆菌DNA成份。

细胞炎性体反应可以受到结核分枝杆菌效应蛋白调控,如Rv0198c(Zmp1)能阻止caspase-1依赖的IL-1β成熟及分泌,Rv0198c基因缺失的结核分枝杆菌能激发炎性体的生成、增加IL-1β释放、增强含有结核分枝杆菌的吞噬体成熟及对结核分枝杆菌的清除,改善被结核分枝杆菌感染小鼠肺部感染状况,是结核分枝杆菌重要的毒力因子及抗结核药物开发靶点。

结核分枝杆菌能通过ESX-1分泌系统阻止AIM2激活,抑制AIM2参与的炎性体生成。对BCG重组疫苗,使其表达能增强炎性体生成的蛋白,可能是疫苗研发的方向之一。

结核分枝杆菌感染引发的细胞反应及其相关调控蛋白[1]

总结

 

先天免疫细胞、相关信号通路及细胞自噬、细胞凋亡等协同作用,参与抵抗结核分枝杆菌感染,杀伤结核分枝杆菌,保护机体免受结核病;但是,结核分枝杆菌具有非常复杂的调控机制调控免疫细胞、信号通路、细胞自噬、细胞凋亡等,保证其在机体长期存活。结核分枝杆菌与机体免疫的对抗平衡,机体会形成肉芽肿,成为结核分枝杆菌携带者;但是当机体免疫力下降时,肉芽肿会破裂,最终导致结核病。研究结核分枝杆调控免疫细胞、信号通路、细胞自噬、细胞凋亡等机制,寻找相关调控蛋白,开发促进结核分枝杆菌自噬、促进炎性体生成、促进被结核分枝杆菌感染细胞进入细胞凋亡、避免细胞坏死的药物、疫苗等将有助于控制结核病。

 

参考文献

1. Liu CH, Liu H, Ge B. Innate immunity in tuberculosis: host defense vs pathogen evasion. Cell Mol Immunol. 2017 Dec;14(12):963-975.

 

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