在探究结核分枝杆菌各基因在菌株生理生态、宿主致病性所主导的功能等重要问题时,通常研究人员会对位于染色体上的靶基因进行定点突变、标记标签甚至敲除。在此本文介绍一种新的Che9c gp60\gp61蛋白介导的基因同源重组方法并应于分枝杆菌(结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌)的基因遗传操作。

 

一.分枝杆菌的基因敲除

选用速生分枝杆菌模式菌株耻垢分枝杆菌作为宿主菌株进行一系列遗传操作。在靶基因的上下游分别设计特异引物从而扩增出500bp的上下游同源片段,经过与抗性筛选基因片段进行Overlap PCR得到同源重组交换双链DNA。此同源重组交换双链DNA被导入到表达Che9c gp60\gp61蛋白的耻垢分枝杆菌宿主菌中。经过同源重组交换双链DNA、Che9c gp60\gp61蛋白以及耻垢分枝杆菌基因组之间的互作,分枝杆菌目的基因被成功敲除。

分枝杆菌的基因敲除示意图

在靶基因的上下游设计特异引物进行扩增验证并且对扩增产物进行测序,多重方法验证目的基因被敲除。

菌株基因组验证PCR

Line 1:野生型耻垢分枝杆菌基因组,Line 2、3:敲除成功的耻垢分枝杆菌基因组,M:Marker

 

二.分枝杆菌的基因融合

选用速生分枝杆菌模式菌株耻垢分枝杆菌作为宿主菌株进行一系列遗传操作。

在靶基因的尾部以及下游分别设计特异引物从而扩增出500bp的无终止密码子的靶基因同源片段以及靶基因下游同源片段,然后经过多重Overlap PCR将500bp的无终止密码子的靶基因同源片段、Linker片段、插入基因片段(如gfp基因片段)、抗性筛选基因片段、500bp的靶基因下游同源片段依次扩增最终得到同源重组交换双链DNA。

此同源重组交换双链DNA被导入到表达Che9c gp60\gp61蛋白的耻垢分枝杆菌宿主菌中。经过同源重组交换双链DNA、Che9c gp60\gp61蛋白以及耻垢分枝杆菌基因组之间的互作,实现外源基因与结核分枝杆菌某目标基因的融合(此处是GFP)。

分枝杆菌的基因融合示意图

在靶基因的内部以及下游设计特异引物进行扩增验证、对扩增产物进行测序以及细胞荧光检测,多重方法验证目的基因融合插入基因。

菌株基因组验证PCR

Line 1:野生型耻垢分枝杆菌基因组,Line 2:基因融合成功的耻垢分枝杆菌基因组,M:Marker

菌株绿色荧光检测

左:野生型耻垢分枝杆菌,右:基因融合成功的耻垢分枝杆菌

 

三.分枝杆菌的基因点突变

在寻找抗分枝杆菌药物作用靶点等研究领域中,通常会对分枝杆菌染色体上的靶基因进行定点突变。在靶基因的后滞链设计合成带有点突变的50~100个寡聚核苷酸链。此寡聚核苷酸链被导入到表达Che9c gp61蛋白的分枝杆菌宿主菌中。经过寡聚核苷酸链、Che9c gp61蛋白以及分枝杆菌基因组之间的互作,分枝杆菌目的基因被成功点突变。

分枝杆菌的基因点突变示意图

【参考文献】

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  3. Murphy Kenan C, Nelson Samantha J, Nambi Subhalaxmi, Papavinasasundaram Kadamba, Baer Christina E, Sassetti Christopher M. ORBIT: a New Paradigm for Genetic Engineering of Mycobacterial Chromosomes. mBio,2018,9(6).
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