耐药性结核分枝杆菌的出现使得结核病的治疗更加严峻。二线抗结核药物对氨基水杨酸(PAS, para-aminosalycilic acid)于1946年被发现可以用于结核病的治疗。PAS是叶酸代谢前体对氨基苯甲酸(pABA, para-aminobenzoic acid)的结构类似物,研究发现PAS作为pABA的结构类似物能够参入叶酸代谢途径而影响叶酸的合成。本文中(Binding Pocket Alterations in Dihydrofolate Synthase Confer Resistance to para-Aminosalicylic Acid in Clinical Isolates of Mycobacterium tuberculosis)赵等人通过对叶酸代谢途径中的关键酶FolC(DHFS, dihydrofolate synthase)的深入研究发现FolC蛋白底物结合区突变导致结核分枝杆菌对PAS产生耐药性。

 

研究人员首先以实验室菌株M. tuberculosis H37Ra、M. bovis BCG为材料,筛选PAS自发耐药突变株,对筛选到的PAS耐药菌株进行全基因组测序及序列比对后,发现大部分folC基因存在突变;同时在临床分离的PAS耐药结核分枝杆菌中也发现FolC有突变。

研究人员进一步通过pMV261质粒在筛选到的自发耐药突变菌株以及临床分离PAS耐药菌株中过表达野生型folC基因,发现耐药菌株对PAS的敏感性恢复到野生型菌株水平。而由于folC基因是必须基因无法直接敲除,因此研究人员先通过pMV361质粒整合突变folC基因(folC43Ile→Ala和folC43Ile→Tyr)到野生型M. tuberculosis H37Ra基因组中,再通过噬菌体介导的同源重组方法敲除菌株中自身野生型folC基因(相当于通过遗传操作用突变型folC基因替换野生型基因),发现这种方法获得的菌株也会对PAS产生耐药。表明结核分枝杆菌PAS耐药与FolC突变有关。

通过比对M. tuberculosis与其他原核生物中的FolC蛋白序列,发现突变位点在物种之间都是高度保守的,通过已解析的蛋白质三维结构分析,发现这些位点主要分布在底物H2Pte(dihydropteroate)结合区域区或附近。

因此,研究人员进一步通过体外表达纯化野生型和4种突变体(I43T, R49W, E153A和A183P)FolC蛋白,通过酶活性测定发现突变后的FolC蛋白对天然底物H2Pte酶活性大大降低,而对PAS参入后形成的底物H2PtePAS(hydroxy dihydropteroate)则完全检测不到酶活性,野生型FolC则能保持一定的酶活性。

一系列的研究结果表明结核分枝杆菌二氢叶酸合成酶FolC突变虽然会导致二氢叶酸合成酶活性的降低,但也同样会导致PAS无法在细菌体内被“活化”,从而阻断其掺入叶酸代谢,进而导致结核分枝杆菌对PAS产生耐药性。PAS耐药新机理的发现,有利于建立临床耐药菌株分子诊断新方法。

关键代谢途径中的蛋白常作为新药开发靶标,因此对结核分枝杆菌重要代谢途径研究有助于深入认识结核分枝杆菌,为新药开发及建立分子诊断新方法等提供帮助。结核分枝杆菌代谢相关基础研究离不开基因敲除及过表达这两大利器,上海晶诺生物科技有限公司已经构建了结核分枝杆菌代谢相关基因同源重组噬菌体,可以用于代谢相关基因的敲除,同时公司还构建了相关基因的过表达质粒,用于构建过表达菌株,为客户提供全面的研究工具,缩短客户研究时间,助力研究人员取得更好的研究成果。

 

阅读原文:

Binding Pocket Alterations in Dihydrofolate Synthase Confer Resistance to para-Aminosalicylic Acid in Clinical Isolates of Mycobacterium tuberculosis

http://aac.asm.org/content/58/3/1479.long

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