上回《睡着了的结核分枝杆菌-1》讲到
低氧、NO、CO如何调控结核分枝杆菌DosS/DosR
这周我们接着讲
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结核分枝杆菌在低氧、NO、CO等环境条件下，DosS、DosT保守的组氨酸残基发生磷酸化，随后会将磷酸基团转移到DosR 54位Asp氨基酸残基处，激活DosR转录调控功能。除了磷酸化调控之外，近期张等人发现DosR活性还受其182位赖氨酸乙酰化修饰调控。
蛋白质赖氨酸乙酰化修饰是蛋白调控的重要方式之一，在自然界中广泛存在，影响细菌DNA复制、代谢、毒性及其他多种生命过程。结核分枝杆菌中蛋白质乙酰化修饰也普遍存在，邓等人通过乙酰化抗体富集胰酶酶解后的肽段进行高分辨质谱分析，鉴定了结核分枝杆菌H37Ra菌株中有137个乙酰化修饰的蛋白[1]；随后谢等人采取类似的策略鉴定到了H37Rv菌株中658个乙酰化修饰的蛋白质，占全蛋白质组的比例高达16.4%[2]。乙酰化修饰谱发现DosR蛋白182位赖氨酸（K182）能够被乙酰化修饰，其蛋白晶体结构表明K182位于蛋白-DNA结合区的保守位点，基于这前期研究结果，张等提出假设，认为乙酰化修饰可能影响DosR对其他基因的转录调控功能[3]。因此张近期论文通过以下实验验证其推测。
一、DosR K182点突变影响DosR与DNA转录调控区的结合
研究人员分别构建了DosR K182R、DosR K182Q突变体蛋白分别模拟其182位去乙酰化和乙酰化蛋白状态，DosRwt为阳性对照，分别与DosR结合的保守DNA片段序列孵育并进行EMSA实验，结果发现DosR K182Q突变体蛋白不能与DNA结合。表明DosR K182乙酰化修饰可能影响DosR与DNA的结合。
二、DosR K182乙酰化后DosR不能与DNA结合
通过遗传工程获得DosR182Ac乙酰化修饰蛋白后，以DosRwt为实验对照组，分别与其结合的保守DNA片段序列孵育并进行EMSA实验，结果表明DosR182Ac乙酰化修饰蛋白不能与DNA结合。
DosRwt、DosRK182R、DosRK182Q、DosR182Ac等不同形式的蛋白与DNA间的空间结构模型分析表明，推测DosR182Ac可能因其182位点的疏水作用使得蛋白无法与DNA结合。
三、DosR182Ac能被NpdA去乙酰化
NpdA（结核分枝杆菌H37Rv菌株中为Rv1151c，H37Ra菌株中为MRA_1161）是结核分枝杆菌中唯一的去乙酰化蛋白酶，其是否影响DosRK182乙酰化还是未知。研究人员表达纯化了Rv1151c，不同浓度的Rv1151c在NAD+或去乙酰化酶抑制剂NAM存在的条件下，与DosR182Ac共孵育，Western blot检测DosR182Ac乙酰化情况，发现Rv1151c能够对DosR182Ac去乙酰化并且其去乙酰化功能能被NAM抑制。进一步通过基因敲除H37Ra菌株中的npdA进行体内实验研究，结果表明npdA基因敲除后的DosR蛋白与野生型菌株相比乙酰化程度显著提高，而在去乙酰化酶抑制剂NAM存在情况下DosR蛋白乙酰化修饰无明显差别。体内外实验表明DosR蛋白是Rv1151c蛋白的底物。
四、DosR182Ac抑制DosR调控基因的转录
将结核分枝杆菌野生型及npdA基因敲除菌株分别在有氧、低氧条件下培养，然后抽提全蛋白并westernblot检测DosR乙酰化修饰情况，结果表明野生型菌株在缺氧条件下DosR乙酰化水平降低，而npdA敲除菌株在有氧、低氧条件下的DosR乙酰化水平无明显变化。
同样将结核分枝杆菌野生型及npdA基因敲除菌株分别在有氧、低氧条件下培养，抽提总RNA，qPCR检测Rv0079、Rv1738、fdxA、tgs1、dosR（DosR调控的相关基因）等基因的转录情况，结果表明npdA基因敲除中这些基因的转录受到影响。
进一步不同浓度的去乙酰化酶抑制剂NAM处理H37Ra菌株，同样检测Rv0079、Rv1738、fdxA、tgs1、dosR等基因的转录情况，发现这些基因转录被抑制，NAM浓度越高，基因转录抑制越显著。
结论
Rv1151c能对DosR去乙酰化影响其乙酰化修饰状态并进而并影响其基因转录调控功能，但是DosR的乙酰化及去乙酰化如何调控还需进一步研究。
参考文献
1. Liu F, Yang M, Wang X, Yang S, Gu J, Zhou J, Zhang XE, Deng J, Ge F. Acetylome analysis reveals diverse functions of lysine acetylation in Mycobacterium tuberculosis. Mol Cell Proteomics. 2014 Dec;13(12):3352-66.
2. Xie L, Wang X, Zeng J, Zhou M, Duan X, Li Q, Zhang Z, Luo H, Pang L, Li W, Liao G, Yu X, Li Y, Huang H, Xie J. Proteome-wide lysine acetylation profiling of the human pathogen Mycobacterium tuberculosis. Int J Biochem Cell Biol. 2015 Feb;59:193-202.
3. Bi J, Gou Z, Zhou F, Chen Y, Gan J, Liu J, Wang H, Zhang X. Acetylation of lysine 182 inhibits the ability of Mycobacterium tuberculosis DosR to bind DNA and regulate gene expression during hypoxia. Emerg Microbes Infect. 2018 Jun 13;7(1):108.
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