聚焦肉芽肿形成、免疫互作与高通量药物筛选
结核病（TB）作为致死性传染病，根据世界卫生组织发布的《2024全球结核病报告》，2023年全球结核病死亡病例达到125万例。随着耐多药结核病（MDR-TB）和广泛耐药结核病（XDR-TB）的蔓延，新型疗法的研发迫在眉睫。临床前研究工具在新药研发中起着关键作用，而斑马鱼-海分枝杆菌（Mycobacterium marinum, Mm）模型凭借独特优势，已成为突破结核病研究瓶颈的关键工具之一。
晶诺生物和芯选检验强强联手，融合双方技术专长，基于斑马鱼海分枝杆菌模型，打造结核病机制探索、抗结核药物筛选与评估等技术平台。
01
海分枝杆菌模型的核心优势
1、高致病性与病理相似性：Mm在进化上是与结核分枝杆菌关系最为密切的非结核分枝杆菌之一，二者编码序列平均氨基酸同一性达 85%，共享大部分毒力基因，感染后可引起类似人类结核病的病理特征，如形成含坏死的肉芽肿，能有效模拟人类 TB 的核心发病机制。
2、操作安全性与便利性：Mm仅导致人类机会性皮肤感染，实验可在生物安全二级（BSL2）设施中开展，无需 BSL3 级别的严格防护，显著降低实验成本与操作门槛。
3、适配斑马鱼模型的高效性：作为斑马鱼的自然病原体，Mm可通过多种注射方式（如卵黄囊、尾静脉）建立稳定感染，结合斑马鱼胚胎 / 幼鱼的透明特性，能实时可视化细菌扩散、免疫细胞募集及肉芽肿动态形成过程，为活体研究提供独特优势。
斑马鱼幼鱼感染Mm后，从细菌入侵到肉芽肿形成、扩散及成熟的完整过程：感染后细菌先被巨噬细胞吞噬（1），形成感染的巨噬细胞（2）；随后感染细胞死亡（3），释放的内容物招募新细胞并使其感染（4），进而在感染部位形成原发肉芽肿（5）；感染细胞逸出引发感染扩散（6），在远端组织形成继发肉芽肿（7）；最终肉芽肿经历从原始到早期再到坏死性的成熟过程（8），成年斑马鱼的肉芽肿还会包含 T 淋巴细胞等更多免疫细胞。
02
海分枝杆菌模型的应用
1、抗结核药物筛选与评估：斑马鱼胚胎繁殖快、易饲养，可低成本实现高通量评估候选药物的抗菌活性与毒性（如心脏毒性、发育异常），加速抗结核药物研发进程。
2、宿主 – 病原体互作机制研究：借助荧光标记技术，可实时观察海分枝杆菌与宿主免疫细胞（如巨噬细胞）的相互作用，解析肉芽肿形成、细菌扩散及宿主免疫调控机制（如自噬、炎症反应）。
3、新型治疗策略开发：支持纳米药物递送系统和宿主定向疗法（HDT）的研究，评估其增强药物有效性、降低毒性及调控宿主免疫的效果。
03
模型构建与评价体系
常用感染途径
卵黄注射：建立系统性感染模型，适合高通量药物筛选，可评估药物对感染扩散的抑制效果；
尾静脉注射：模拟血行播散，可观察早期肉芽肿形成、细菌播散及药物对胞内菌的清除作用。
细菌病原体的给药途径用于建立斑马鱼胚胎感染模型
核心评价指标
通过荧光成像量化细菌负荷和生存曲线分析评估抗菌效果
使用表达红色荧光蛋白Mm感染斑马鱼胚胎，绿色荧光来自人为添加的荧光染料用于标记 “成功注射的胚胎”，通过卵黄显微注射建立感染模型，随后用乙硫异烟胺（ETH，一种抗结核药物）或DMSO浸泡处理，分别在感染后5天进行荧光成像与生存状态评估。
多维评价指标
分组：空白组、模型组、阳性对照（异烟肼或利福平）、实验组
该模型为结核病的病理机制研究、药物研发及新型疗法验证提供了高效、可靠的工具，有望加速解决耐多药结核病的临床难题。
04
斑马鱼分枝杆菌模型的应用案例
应用一：揭示结核肉芽肿形成与自噬防御的关键机制
分枝杆菌（红色）通过分泌毒力因子ESAT6，诱导宿主上皮细胞（棕色）释放基质金属蛋白酶Mmp9，促进巨噬细胞募集和肉芽肿扩张的过程。同时，受感染巨噬细胞与未感染巨噬细胞间通过 Cxcr3-Cxcl11 信号轴相互作用，进一步驱动细胞聚集。
ESAT6-MMP9轴驱动肉芽肿播散
分枝杆菌通过ESX-1 系统突破吞噬体膜进入胞质后，被泛素化标记，随后通过 STING 依赖的选择性自噬途径被包裹。DRAM1 通过促进自噬体与溶酶体融合，增强杀菌能力，且小自噬囊泡可能递送抗菌肽强化清除。
巨噬细胞中 DRAM1自噬通路介导宿主防御
研究案例
题目：mTOR 调节的线粒体代谢限制分枝杆菌诱导的细胞毒性
mTOR-regulated mitochondrial metabolism limits mycobacterium-induced cytotoxicity
摘要：该研究以斑马鱼和THP-1 巨噬细胞为模型，探究了 mTOR 在分枝杆菌感染中的作用。通过基因编辑构建斑马鱼mTOR 突变体（如mtorfh178/fh178），结合显微注射及荧光成像技术，实时观察感染后细菌负荷、肉芽肿形成与破裂及 细菌成索等现象，说明mTOR 缺陷会增强斑马鱼对分枝杆菌感染的敏感性，加速巨噬细胞死亡和肉芽肿破裂；THP-1 巨噬细胞模型则通过药物（如torin1、雷帕霉素）抑制 mTOR，结合流式细胞术、代谢组学分析及荧光染色（如 TMRE 染色检测线粒体膜电位）等方法，研究发现 mTOR 通过增强糖酵解驱动的线粒体氧化磷酸化（OXPHOS），维持线粒体功能，从而保护巨噬细胞免受分枝杆菌毒力因子 ESAT-6 介导的线粒体损伤和死亡。这一发现揭示了 mTOR 通过调节线粒体代谢抵抗分枝杆菌诱导的细胞毒性的机制，为结核病的研究和治疗提供了新的视角。
部分研究结果图展示：
应用二：发现抗结核新生物活性化合物
结核药物毒性评价
新生物活性化合物使用过程中的副作用和毒性作用检测是药物研发的关键因素。在药物研发早期阶段，斑马鱼毒性试验能快速提供与化合物体内毒性相关的结果，若不适用完整生物体很难预测多药效应或特定代谢物。基于斑马鱼胚胎的透明性以及发育迅速，主要通过行为学和形态学观测来评估发育毒性相关的畸形或神经毒性、以及器官毒性（如心脏毒性导致的心脏功能障碍）等。
结核药物筛选与新型抗结核治疗策略研究
由于斑马鱼胚胎/幼鱼透明，体型小，高繁殖率、低成本等优势可广泛用于抗结核药物的高通量筛选以及新型治疗策略研究，如不同纳米制剂作为抗结核药物递送载体对药物功效的增强和毒性降低作用；筛选和评价通过调节宿主免疫或生理过程发挥抗结核作用的宿主导向疗法研究等。常用的给药方式包括水暴露、以及显微注射等，主要通过检测细菌负荷（如荧光定量）、肉芽肿数量与大小，斑马鱼存活率等指标，评估药物对抑菌效果，同时能评估药物的剂量依赖性效应。
应用案例：
题目：使用斑马鱼感染模型的抗结核化合物筛选鉴定出一种天冬氨酸-tRNA合成酶抑制剂
An anti-tuberculosis compound screen using a zebrafish infection model identifies an aspartyI-tRNA synthetase inhibitor
摘要：寻找具有显著体内活性的新型抗结核化合物，是全球抗击耐多药结核分枝杆菌分离株出现的持续挑战。本研究利用斑马鱼胚胎感染模型的中通量筛选能力，以海洋分枝杆菌替代结核分枝杆菌进行实验。通过临床常用药物的代表性筛选，证明该模型可预测并筛选口服给药抗生素。进一步使用斑马鱼感染模型对240种抗结核候选化合物进行体内活性筛选，最终鉴定出14种高活性化合物。其中活性最强的四环化合物TBA161被深入研究。抗性突变体分析显示，编码天冬氨酰-tRNA合成酶的aspS基因（Rv2572c）存在点突变。该靶点经遗传学验证后，分子对接研究表明TBA161可能结合在催化位点邻近的口袋区域。本研究证实斑马鱼感染模型适用于快速筛选具有体内活性的潜在骨架结构。
部分结果图示
筛选流程与结果。先通过体外实验筛选出对海分枝杆菌抑制率≥80% 的240种化合物，再用这240 种化合物处理感染海分枝杆菌的斑马鱼胚胎，观察 5 天内胚胎的死亡率和表型异常（如发育缺陷），排除 91 种具有毒性或致死效应的化合物，对于剩余149 种无毒化合物，通过量化斑马鱼胚胎内海分枝杆菌的荧光强度，评估其降低细菌负荷的能力，筛选出 14 种能显著减少细菌负荷的化合物。
题目：藏药通过促进斑马鱼炎症细胞因子的产生来改善宿主抗分枝杆菌反应
Tibetan medicine salidroside improves host anti-mycobacterial response by boosting inflammatory cytokine production in zebrafish
摘要：结核病（TB）的治疗周期往往漫长，尤其是耐多药结核病（MDRTB），最长可达一年。这在一定程度上源于缺乏有效的治疗手段。从宿主免疫调节角度开发新型抗结核药物，可为传统治疗策略提供重要补充。藏药红景天中的生物活性成分沙利多糖（SAL）虽已用于结核病治疗，但其作用机制尚不明确。本研究首次通过斑马鱼-海洋分枝杆菌感染模型证实了SAL在体内的抑菌效果。为进一步探究其作用机制，评估了SAL对伤口和感染部位免疫细胞募集的影响。与对照组相比，SAL处理后伤口及感染部位的巨噬细胞和中性粒细胞浸润明显增加，这可能是由于SAL处理后趋化因子表达水平升高所致。单独使用SAL治疗可显著提高感染斑马鱼幼体的存活率，当与异烟肼或利福平联用时效果更佳。值得注意的是，在Tnfα缺陷型胚胎中，SAL处理带来的细菌负荷降低和存活率提升效果减弱，这表明Tnfα信号通路对SAL的抗分枝杆菌作用具有关键调控作用。总之，本研究不仅为藏药SAL的宿主抗分枝杆菌作用提供了细胞和分子机制，也证明了SAL联合应用传统一线抗结核药物可以是一种提高治疗效果的新策略。
SAL对斑马鱼胚胎发育毒性评估。SAL在 0.8–12.8 mM 浓度范围内，对斑马鱼胚胎的生长发育无影响，无畸形或死亡现象。
体内外抗菌效果评估。体外实验中SAL对M.m无直接抑制作用，而在斑马鱼体内以及巨噬细胞感染模型中表现出了抗菌活性，说明SAL 通过调节宿主免疫而非直接杀菌发挥作用。
参考文献
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晶诺生物的分枝杆菌技术服务
晶诺生物已有成熟的分枝杆菌基因敲除、回补和过表达菌株构建经验，可以满足不同的实验需求。
1、敲除菌株或点突变菌株：采用噬菌体介导或pJV53介导的同源重组法
2、回补和过表达菌株：采用pMV261或pMV361质粒
3、荧光菌株：可选eGFP、mCherry等荧光标记
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