Product Description
【背景介绍】
自噬是细胞内的一种“自食〔Self-eating〕”的现象，凋亡是“自杀〔Self-killing〕”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚。自噬是指膜〔目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层〕包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。目前文献对自噬过程进行观察和检测常用的策略和手段有：通过western blot检测LC3的剪切；通过电镜观测自噬体的形成；在荧光显微镜下采用GFP〔-RFP〕-LC3等融合蛋白来示踪自噬体形成以与降解。
近几年对自噬流的研究日趋增多，针对于此我们自主研发了用于实时监测自噬(流)的mRFP-GFP-LC3腺病毒，mRFP用于标记与追踪LC3，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。这种串联的荧光蛋白表达载体系统直观清晰的指示了细胞自噬流的水平，是我们自噬研究尤其是自噬流研究不可或缺的利器。
【实验准备】
本产品是以复制缺陷型腺病毒DNA为骨架构建成的重组腺病毒系统。但该病毒仍然具有潜在的生物学危险性，强烈建议将本系统生产的腺病毒视为二级生物安全水平的生物，严格遵守BSL-2或BSL-2+操作手册并进行相应的废弃物消毒。
※使用前请准备和检查：
- 使用者防护措施：
一次性手套；口罩；护目镜/面罩；实验服/一次性手术服。
- 操作环境：推荐：Class II生物安全柜。仅有普通超净工作台情况下，使用时不要打开风机。
- 安全提示：
- 避免在操作病毒时使用利器，如需要注射病毒，请选用安全针头。
- 避免储存病毒的离心管或其它容器在离开生物安全柜或超净工作台的情况下处于打开状态。
- 避免出现以上未提及但可能造成病毒暴露在空气或发生污染的其它情况。
【收到病毒后的处理】
〔一〕、腺病毒的储存
1、腺病毒采用冰袋运输。
〔1〕、收到病毒液后如未融化请置于-80℃冰箱，下次使用时再进行分装；
〔2〕、如客户收到时腺病毒已融化，请直接分装后置于-80℃冰箱保存；若短期内用于实验，可分装部分于4℃保存〔尽量一周内用完〕。
2、尽量避免反复冻融，否则会降低病毒滴度〔每次冻融会降低病毒滴度10%〕。建议不要在-20℃下长期保存。如果病毒储存时间超过6个月，应该重新测定病毒滴度。
3、建议收到病毒产品后根据实验需求自行分装或购买经过分装的小包装病毒产品〔购买时请提出〕。
〔二〕、腺病毒的稀释
需要稀释病毒时，将病毒取出后置于冰上融解，使用培养目的细胞用PBS或培养基稀释到所需浓度后混匀分装后4℃保存，并尽快用于实验〔尽量一周内用完〕，动物实验建议使用注射用平衡液来稀释，并尽快用完。
【用量计算】
病毒的滴度：病毒的滴度(Titer)是指单位体积病毒液中具有活性的病毒单位数量，是衡量病毒质量的核心指标。腺病毒的滴度一般表示为PFU/ml，PFU(Plaque Forming Unit)，采用壳蛋白免疫法进行腺病毒滴度的检测。
感染复数（MOI）：感染复数（multiplicity of infection, MOI)，含义为感染时病毒和细胞数量的比值，即平均每个细胞感染的病毒活性单位数。在实验中将某种细胞感染达到80%时的MOI定义为这种细胞的最适MOI。
影响MOI的因素包括：细胞状态，目的基因的大小与性质，细胞的种类等。
病毒用量的计算公式：病毒液体积 = 细胞数 × MOI / 病毒滴度
【细胞感染操作】
略
【统计方法】
我们在显微镜成像后红绿荧光merge后通过merge后出现的黄色斑点指示自噬体，红色斑点指示自噬溶酶体。通过不同颜色斑点的计数可以清晰的看出自噬流的强弱：一般统计采用人为计数的方法，也就是统计叠加〔overlay〕之后黄色斑点和红色斑点的数目，然后做出bar图。
如下图：细胞转染mRFP-GFP-LC3病毒后给予氨基酸剥夺处理2小时后出现明显增强的自噬以与自噬流〔通过merge后的红色小点明显增多可以判定自噬流水平升高〕。
【病毒灭活】
病毒的灭活（可选方法）：
- 10%次氯酸钠溶液；
- 2%戊二醛；
- 4%甲醛；
- 70%酒精；
- 1% SDS。
污染材料、标本和培养物的处理：
- 废弃的含病毒的培养基加入84消毒液(1:20左右)，浸泡一天后丢弃。
- 接触过病毒的枪头，离心管，培养板等其他物品可用84消毒液稀释液处理，也可以用煮沸处理半小时或高压湿热灭菌(121℃，30 min)。
