蛋白与蛋白相互作用是发挥蛋白功能、维持正常生命活动所不可或缺的,研究蛋白-蛋白相互作用的技术有免疫沉淀(immunoprecipitation)、免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)、荧光蛋白标记、双分子荧光互补技术(BIFC)、酵母双杂交等。

常见的蛋白-蛋白互作检测技术各有优缺点,如免疫沉淀适用于非跨膜蛋白,跨膜蛋白表达纯化后由于脱离了膜环境而使其空间结构发生改变,影响到其蛋白功能并进而影响免疫沉淀效果;荧光蛋白、双分子荧光互补技术等需要明确两种或多种蛋白,检测后若这些蛋白无相互作用,还需重新实验确认其他蛋白与目的蛋白的相互作用,操作繁琐。

针对现有蛋白互作检测技术的不足,仍需开发新技术,新技术需具有修饰特定蛋白后能够筛选到相互蛋白、能用于活细胞、易于检测、能检测蛋白间弱相互作用等优点,这将使得蛋白互作检测工作更容易展开,对信号通路等研究意义重大。

最近Nature Method发表的检测蛋白-蛋白相互作用的PUP-IT技术引起了研究人员的关注,该技术参考了2011年发表的BioID及2012年发表的APEX技术,下面我们将介绍BioID、APEX、PUP-IT三种蛋白互作检测技术的原理及应用。

 

BioID技术

BioID技术由Kyle J. Roux等人发明,借鉴了Henikoff等人的DamID技术,研究论文A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells发表于JCB杂志上。

BioID技术依据的是邻近蛋白标记的原理,在目标蛋白上连接大肠杆菌生物素连接酶,在生物素存在的条件下,目标蛋白邻近蛋白会被标记上生物素,随后可通过亲和素将生物素标记蛋白吸附并进行质谱检测即可确定目标蛋白邻近蛋白。BioID技术出现之后被用于溶酶体、染色体、核孔复合体等细胞器中蛋白相互作用检测,应用广泛。

BioID技术路线

研究人员最初将大肠杆菌生物素连接酶BirA的突变体连接到核纤层蛋白LamA上,在Hek293细胞中表达,添加生物素后检测了与LamA邻近及结合的蛋白。结果表明BioID筛选到了12个蛋白与LamA邻近,这12个蛋白包括Nup153、Nup50、ELYS、Tpr等,这些蛋白间的结合之前已经通过传统的蛋白互作检测方法证实,证明BioID技术能用于蛋白-蛋白相互作用的检测。

BioID技术检测LamA蛋白互作蛋白

 

APEX技术

APEX(engineered ascorbate peroxidase)将植物中的抗坏血酸过氧化物酶突变体代替BioID技术中的生物素连接酶。在细胞中表达抗坏血酸过氧化物酶-目标蛋白融合蛋白,细胞与生物素-苯酚共孵育,在过氧化氢存在时会产生短生自由基(short-lived radicals),短生自由基能与目标蛋白周边蛋白的酪氨酸、组氨酸、色氨酸等共价结合,后可通过亲和素吸附生物素化蛋白并质谱检测对蛋白进行鉴定。

APEX技术检测蛋白相互作用原理

APEX技术可用于高分辨率显微镜观测细胞亚显微结构,有研究者应用该技术对线粒体基质蛋白质组进行了分析,确定了500种左右蛋白为线粒体基质蛋白,其中有30种是没有报道过的;APEX技术用于内质网研究后发现了一种新的多次跨膜蛋白STIMATE,该蛋白是一种钙离子感受蛋白,由TMEM110基因编码。

APEX与BioID技术相比具有标记快(在过氧化氢存在时,仅需1min即可将目标蛋白邻近蛋白标记,而BioID需要十几个小时才能大量标记邻近蛋白);能够用于细胞亚显微结构电子显微镜观测。但是APEX也有缺点,如对弱相互作用蛋白检测能力较差、对表面无酪氨酸等氨基酸的蛋白无法检测、过氧化氢对细胞有损伤等。

 

PUP-IT技术

PUP-IT技术是由上海科技大学庄敏教授等发明的检测蛋白相互作用的新技术,文章A proximity-tagging system to identify membrane protein–protein interactions发表在Nature Methods上。PUP-IT技术与Bio-ID技术原理类似,都基于蛋白邻近相互作用原理,所不同的地方在于PUP-IT采用的是Pup连接酶而不是生物素连接酶。Pup连接酶由PafA基因编码,Pup蛋白是由64个氨基酸组成的小分子蛋白,在ATP存在的情况下Pup连接酶能将Pup蛋白C末端Gly-Gly-Glu中的Glu残基磷酸化并将Pup蛋白连接到底物蛋白的赖氨酸残基上,形成稳定的蛋白复合体结构,方便富集分析。PUP-IT技术流程大致为构建PafA-目的蛋白融合蛋白,在底物Pup存在时将Pup标记到与目的蛋白结合的蛋白上,后进行PAGE凝胶电泳,切胶后进行质谱分析或蛋白氨基酸测序。

PUP-IT技术模式图

利用PUP-IT技术,庄等人检测了泛素连接酶Cul3 SPOP亚基的MATH结构域与短肽Pep1、Pep2、Pep3的相互作用;检测了跨膜蛋白CD28细胞质部分的结合蛋白,验证了已报到的结合蛋白p85、ITK、LCK,也找到了许多未报到的蛋白;检测了CD28、白介素2受体IL2R与配体的结合。用TET-On调控Pup在细胞中的表达,改进了PUP-IT技术在细胞中应用时存在的非特异性信号等。

 

总结

BioID、APEX、PUP-IT技术都基于蛋白邻近相互作用原理,能在活细胞中应用,检测细胞膜、细胞质、细胞器、细胞核等不同部位的蛋白,也能够用于细胞-细胞、病原体-细胞等相互作用检测,方便蛋白转运、信号通路等的研究,有助于致病机理、药物研发等,但是这些技术能最大化的筛选到目的蛋白邻近蛋白,并不能说明这些蛋白一定相互作用,仍需免疫沉淀、荧光标记等传统蛋白互作检测技术进行验证。

 

参考文献

  1. Roux KJ, Kim DI, Raida M, Burke B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. J Cell Biol. 2012 Mar 19;196(6):801-10.
  2. Martell JD, Deerinck TJ, Sancak Y, Poulos TL, Mootha VK, Sosinsky GE, Ellisman MH, Ting AY. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nat Biotechnol. 2012 Nov;30(11):1143-8.
  3. Dae In Kim and Kyle J. Roux. Filling the void: Proximity-based labeling of proteins in living cells. Trends Cell Biol. 2016 November ; 26(11): 804–817.
  4. Liu Q, Zheng J, Sun W, Huo Y, Zhang L, Hao P, Wang H, Zhuang M. A proximity-tagging system to identify membrane protein-protein interactions. Nat Methods. 2018 Sep;15(9):715-722.